玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）,又名山琉、洛神花、芙蓉煎,是锦葵科木槿属的一年生草本植物[1]。花萼呈紫红色,具有降血糖、降血脂、降血压、抗癌、改善消化系统等药理作用[2],含有丰富的碳水化合物、有机酸、粗蛋白、粗脂肪、多酚和总黄酮[3]。其中,总黄酮有黄酮醇和黄烷醇,它们以单体或聚合物的形式存在[4]。目前关于玫瑰茄栽培、加工研究报道较多,如李秀芬等[5]研究了玫瑰茄引种栽培技术,洪璇等[6]研究了玫瑰茄果冻配方及加工工艺,李玉珠等[7]研究了玫瑰茄酒发酵工艺。但是针对玫瑰茄总黄酮提取工艺的研究报道很少,仅有王丽岩等[8]研究了超声波辅助提取玫瑰茄总黄酮工艺,但采用超声波提取易出现受热不均、产热不足等问题。
研究表明,总黄酮是一类有较强生物活性物质[9],具有消炎、抗菌、抗突变、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等功效[10,11]。植物黄酮类化合物提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、超声波辅助提取、超声波酶法提取、超声波-微波协同提取法等[12,13,14,15]。超声波-微波协同提取是近年来发展起来的新技术,具有节约能耗、增大提取率、缩短提取时间、易于操作等优点,但应用在玫瑰茄总黄酮提取尚未见报道。本研究以福建漳州产地的玫瑰茄干花萼为原料,采用超声波-微波协同提取技术,利用Box-Behnken响应面试验设计法优化提取工艺,并以维生素C为对照,测定玫瑰茄总黄酮抗氧化活性,旨在为玫瑰茄总黄酮的相关研究提供实验依据,以期为玫瑰茄在功能食品中的开发利用和新型抗氧化剂的开发提供理论依据,为玫瑰茄综合利用开辟一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
玫瑰茄:市售,产地为福建漳州;芦丁标准品（中国药品生物制品检定所,纯度≥98%）;抗坏血酸（维生素C,南京建成生物工程研究所,纯度为99%）;DPPH自由基（上海铭博生物科技有限公司,纯度为96%）;无水乙醇、乙酸乙酯、NaNO2、Na2CO3、Al(NO3)3等化学试剂均为国产分析纯。
ME204电子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;CW-2000超声-微波协同萃取仪,上海新拓微波溶样测试技术有限公司;UV-1800-DS2紫外-可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;LGR10-4.2高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器设备公司。
1.2 方法
1.2.1 玫瑰茄总黄酮的提取工艺流程 玫瑰茄花萼→清洗→烘干→粉碎→过筛→干粉→称量→料液混匀→超声波-微波协同提取→过滤→离心分离→得上清液。
1.2.2 芦丁标准曲线的绘制及玫瑰茄总黄酮提取量计算 在参考前人研究结果[16]的基础上稍作修改。精密称取质量恒定的5.0 mg芦丁标准品,用60%乙醇定容至50 mL,即为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。准确量取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于50 mL容量瓶中,各加入1.0 mL 5% NaNO2溶液,摇匀,静置6 min;然后分别加入1.0 mL 10% Al(NO3)3水溶液,摇匀,静置6 min;再分别加入10.0 mL 4% NaOH,摇匀,最后用60%乙醇稀释至刻度,静置15 min。通过预实验可知芦丁和玫瑰茄总黄酮最大吸收波长为510 nm,因此在510 nm处测定吸光度。以60%乙醇作空白对照,以吸光度A为纵坐标,以芦丁质量浓度C（mg/mL）为横坐标,绘制标准曲线,得到芦丁质量浓度C（mg/mL）与吸光度A之间的回归方程C=0.0950A-0.0006,R2=0.9998,表明吸光值与芦丁质量浓度线性关系良好。
玫瑰茄总黄酮提取量计算[17]。量取1.0 mL上清液置于50 mL容量瓶,按标准曲线的测定步骤,测得样品的吸光度,得样品总黄酮质量浓度,并计算样品总黄酮提取量。
总黄酮提取量(mg/g)=$\frac{C\times N\times V}{M}$
式中:C为样品提取液总黄酮质量浓度,mg/mL;N为稀释倍数;V为样品提取液体积,mL;M为样品质量,g。
1.2.3 单因素试验 （1）乙醇浓度对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。总黄酮易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂,从溶剂毒性和价格考虑,选择乙醇为提取剂,超声波功率为50 W（仪器限制,超声波功率限定为50 W）。设乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%,液固比10:1（mL/g）,提取时间10 min,微波功率150 W,提取1次,考察乙醇浓度对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。
（2）液固比对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。设液固比分别为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1（mL/g）,乙醇浓度40%,提取时间10 min,微波功率为150 W,提取1次,考察液固比对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。
（3）提取时间对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。设提取时间分别为10、15、20、25、30 min,乙醇浓度40%,液固比为50:1（mL/g）,微波功率150 W,提取1次,考察提取时间对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。
（4）微波功率对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。微波功率分别为150、200、250、300、350、400 W,乙醇浓度40%,液固比为50:1（mL/g）,提取时间20 min,提取1次,考察微波功率对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。
（5）提取次数对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。设提取次数分别为1、2、3次,乙醇浓度40%,液固比为50:1（mL/g）,提取时间20 min,微波功率250 W。考察提取次数对玫瑰茄总黄酮提取量的影响。
1.2.4 响应面优化试验设计 在单因素试验基础上,影响玫瑰茄总黄酮提取量的3个关键因素为乙醇浓度、液固比和微波功率,采用响应面法中的 Box-Behnken模型优化试验设计。响应面试验因素水平如表1所示。
表1 响应面试验因素水平表Tab. 1 Factors and levels of response surface experiment |
| 水平 Levels | 因素Factors | ||
|---|---|---|---|
| A液固比 Liquid-material ratio/(mL·g-1) | B 乙醇浓度 Ethanol concentration/% | C 微波功率 Microwave power/W | |
| -1 | 40:1 | 30 | 200 |
| 0 | 50:1 | 40 | 250 |
| 1 | 60:1 | 50 | 300 |
1.2.5 加标回收率测定 按照最优提取工艺条件提取玫瑰茄总黄酮3份,分别加入芦丁标准溶液,混匀,于510 nm处测吸光度得总黄酮含量,计算加标回收率,其计算公式为:
$加标回收率=\frac{加标试样测定值试样测定值}{加标量}\times 100\%$
1.2.6 玫瑰茄总黄酮的纯化 将玫瑰茄总黄酮粗提液置于真空旋转蒸发仪55 ℃减压浓缩。后用温水将浓缩物搅拌溶解,石油醚萃取脂类物质和色素类物质3次。将萃取液用乙酸乙酯（1:1）萃取总黄酮3次,合并萃取液,真空抽滤,减压浓缩,于65 ℃真空干燥。将上述黄酮粉与5% Na2CO3溶液混合均匀,两者比例为1:100,调pH为5.0~6.0,用乙酸乙酯萃取3次,真空抽滤、减压浓缩、真空干燥,最终得到纯化后的玫瑰茄总黄酮[18]。
1.2.7 玫瑰茄总黄酮抗氧化性研究 （1）玫瑰茄总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-•）的清除作用。在参考文献[19]基础上稍作修改,精确量取1.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL粗提物和纯化物于50 mL容量瓶,分别加入8.0 mL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2）,25 ℃水浴20 min,取出后再加入1.0 mL 25 mmol/L邻苯三酚,混匀,静置5 min,立刻加入4滴10 mol/L HCl终止反应,在波长325 nm处测吸光度K1,用蒸馏水代替邻苯三酚同法测定吸光度K2,以1.0 mL蒸馏水代替样品液同法测定吸光度K3,以维生素C作为对照。O2-•清除率按下式计算。
O2-•清除率=$(1-\frac{K1-K2}{K3})×100\%$
式中:K1为样品液吸光度;K2为对照液吸光度;K3为空白液吸光度。
（2）玫瑰茄总黄酮对DPPH自由基的清除作用。在参考文献[20]基础上稍作修改,准确移取1.0 mL 0.1 mg/mL DPPH溶液,分别加入1.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL粗提物和纯化物于比色管中,混匀,黑暗中静置30 min,517 nm波长处测吸光度。以维生素C作为对照。DPPH自由基清除率按下式计算:
DPPH•清除率=(1-$\frac{B1-B2}{B0}$)×100%
式中:B1为样品加DPPH溶液吸光度;B2为样品加乙醇溶剂吸光度;B0为不加样品空白对照液吸光度。
1.3 数据处理
采用SPSS 21.0软件对单因素试验结果进行方差分析,采用Design Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行统计分析,试验数据均为3次平行试验的平均值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对玫瑰茄总黄酮提取量的影响 由图1可知,玫瑰茄总黄酮提取量随着乙醇浓度的增大呈现先增加后减少的趋势,乙醇浓度为40%时,提取量最高。其原因是乙醇溶液极性与总黄酮极性相似,随着乙醇浓度的增大,总黄酮易溶出,使得提取量增大,但是乙醇浓度过高时,醇溶性物质如蛋白质、儿茶素等物质溶出,降低总黄酮提取量。因此,选定乙醇浓度为40%。
2.1.2 液固比对玫瑰茄总黄酮提取量的影响 由图2可知,液固比为10:1~50:1（mL/g）,提取量随着液固比增大而增加,当液固比为50:1（mL/g）时,提取量最高,液固比为50:1~60:1（mL/g）时,提取量随着液固比增大而减少,其原因是乙醇溶剂用量的增加,有利于总黄酮溶出,提取量迅速增加,但是溶剂用量过多,其他物质如色素等也会溶解出来,导致提取量降低。因此,选定液固比为50:1（mL/g）。
2.1.3 提取时间对玫瑰茄总黄酮提取量的影响 由图3可知,提取量随着提取时间的延长呈现先增加后减少的趋势,当提取时间为20 min时,提取量最高。其原因是随着提取时间延长,细胞内黄酮类活性物质充分与乙醇溶剂接触,使得更多黄酮类化合物溶出,提取量增大,但提取时间太长,导致其他非黄酮类活性物质溶出,总黄酮提取量反而下降。所以,最佳提取时间为20 min。
2.1.4 微波功率对玫瑰茄总黄酮提取量的影响 由图4可知,玫瑰茄总黄酮提取量随着微波功率升高先增大后减少。当微波功率是250 W时,提取量最高,其原因是微波功率升高,有利于软化和破坏细胞壁,使更多黄酮类物质溶出,但是功率太高,会造成提取液温度提升较快,使得部分黄酮类物质因受热不均而失去活性,而且功率过高,溶剂挥发速度加快,导致总黄酮含量下降,所以,选定微波功率为250 W。
2.1.5 提取次数对玫瑰茄总黄酮提取量的影响 由图5可知,增大提取次数,有利于玫瑰茄总黄酮的提取,当提取次数为3次时,玫瑰茄总黄酮提取量最高,但是同提取2次比较,提取量相差不大,仅相差0.9 mg/g,说明提取次数对玫瑰茄总黄酮提取量影响不显著,为了节约能耗,选择提取次数为2次最优。
2.2 各单因素与玫瑰茄总黄酮提取量的方差分析
表2 单因素试验方差分析结果Tab. 2 Variance analysis on single-factor experiment |
| 因素Factor | F值 F value | P值 P value |
|---|---|---|
| 液固比/(mL·g-1) | 369.15 | <0.0001** |
| 乙醇浓度/% | 145.70 | <0.0001** |
| 提取时间/min | 9.62 | 0.0173* |
| 微波功率/W | 50.8 | 0.0002** |
| 提取次数 | 4.19 | 0.08 |
Note: ** indicates extremely significant difference at 0.01 level, and * indicates significant difference at 0.05 level. | |
注:**表示影响极显著（P<0.01）;*表示影响显著（P<0.05） |
2.3 玫瑰茄总黄酮提取条件响应面试验结果及分析
表3 Box-Behnken设计方案及试验结果Tab. 3 Box-Behnken design and results |
| 试验号 Test number | 液固比 Liquid-material ratio/(mL·g-1) | 乙醇浓度 Ethanol concentration/% | 微波功率 Microwave power/W | 总黄酮提取量 Flavonoids extraction/ (mg·g-1) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | -1 | -1 | 0 | 27.3 |
| 2 | 1 | -1 | 0 | 14.5 |
| 3 | -1 | 1 | 0 | 15.9 |
| 4 | 1 | 1 | 0 | 21.3 |
| 5 | -1 | 0 | -1 | 25.6 |
| 6 | 1 | 0 | -1 | 19.2 |
| 7 | -1 | 0 | 1 | 25.2 |
| 8 | 1 | 0 | 1 | 21.1 |
| 9 | 0 | -1 | -1 | 22.1 |
| 10 | 0 | 1 | -1 | 15.5 |
| 11 | 0 | -1 | 1 | 20.2 |
| 12 | 0 | 1 | 1 | 20.8 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 40.2 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 40.4 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 41.3 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 40.6 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 41.0 |
表4 回归方程的方差分析Tab. 4 Analysis of variance of regression equation |
| 方差来源 Sources of variance | 平方和 Quadratic sum | 自由度 Variance | 均方 Mean square | F值 F value | P值 P value | 显著性 Significant |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 1587.66 | 9 | 176.41 | 457.78 | <0.0001 | ** |
| A | 40.05 | 1 | 40.05 | 103.93 | <0.0001 | ** |
| B | 14.05 | 1 | 14.05 | 36.45 | 0.0005 | ** |
| C | 3.00 | 1 | 3.00 | 7.79 | 0.0269 | * |
| AB | 82.81 | 1 | 82.81 | 214.89 | <0.0001 | ** |
| AC | 1.32 | 1 | 1.32 | 3.43 | 0.1064 | |
| BC | 12.96 | 1 | 12.96 | 33.63 | 0.0007 | ** |
| A2 | 334.45 | 1 | 334.45 | 867.90 | <0.0001 | ** |
| B2 | 610.11 | 1 | 610.11 | 1583.24 | <0.0001 | ** |
| C2 | 342.00 | 1 | 342.00 | 887.49 | <0.0001 | ** |
| 残差 | 2.70 | 7 | 0.39 | |||
| 失拟项 | 1.90 | 3 | 0.63 | 3.16 | 0.1476 | |
| 纯误差 | 0.80 | 4 | 0.20 | |||
| 所有项 | 1590.36 | 16 |
Note: ** represents extremely significant difference (P<0.01), and * represents significant difference (P<0.05). | |
注:**表示影响极显著（P<0.01）,*表示影响显著（P<0.05）。 |
由表4可知模型的P<0.01,表明回归模型极显著;该模型的失拟项P>0.05,不显著,表明该回归方程拟合度和可靠性较高,可以作为预测玫瑰茄总黄酮最优提取工艺参数的模型。在回归方程中,A、AB、A2、B2、C2 对总黄酮提取量影响极显著,B、C、BC对总黄酮提取量影响显著。AC对总黄酮提取量影响不显著。由F值可得影响总黄酮提取量各因素顺序为:液固比（A）>乙醇浓度（B）>微波功率（C）。2.3.2 等高线和响应面分析因素间的交互作用 液固比、乙醇浓度和微波功率两两交互作用等高线及响应面见图6、图7、图8。液固比和乙醇浓度响应面较陡,等高线为椭圆形,说明它们之间的交互作用对响应值影响显著;乙醇浓度和微波功率响应面较陡,等高线为椭圆形,说明它们之间的交互作用对响应值影响显著;液固比和微波功率响应面较平滑,等高线为圆形,说明它们之间的交互作用对响应值影响不显著。由图6A等高线的疏密程度可知,乙醇浓度比轴的等高线变化密集,而液固比比轴的等高线变化稀疏,所以与乙醇浓度相比,液固比对响应值峰值的影响更大;从图7A可知液固比对响应值峰值的影响比微波功率更大;从图8A可知乙醇浓度对响应面峰值影响比微波功率更大。由图6B、图7A、图7B、图8A、图8B可知,液固比对响应值的影响最为显著,表现为曲线坡度较陡;而乙醇浓度和微波功率次之,表现为较液固比曲线更为平滑。因此,影响玫瑰茄总黄酮提取量影响主次是液固比>乙醇浓度>微波功率。这一点,同表3分析结果一致。
图6 液固比和乙醇浓度对玫瑰茄总黄酮提取量影响的等高线（A）和响应面（B）Fig. 6 Contour plot (A) and response surface (B) showing interactive effect of liquid- material ratio and ethanol concentration on flavonoids extraction of H. sabdariffa L. |
图7 液固比和微波功率对玫瑰茄总黄酮提取量影响的等高线（A）和响应面（B）Fig. 7 Contour plot (A) and response surface (B) showing interactive effect of liquid- material ratio and microwave power on flavonoids extraction of H. sabdariffa L. |
2.4 响应面试验模型的验证
由Design-Expert 8.0.5软件分析得最佳提取工艺条件为液固比48.55:1 mL/g、乙醇浓度39.19%、微波功率251.08 W,在此条件下,玫瑰茄总黄酮提取量预测值为40.9 mg/g。考虑到便于操作,最终确定提取最佳工艺条件为液固比50:1 mL/g、乙醇浓度40%、微波功率250 W。为了检验试验设计所得结果的可靠性,采用上述最佳工艺条件平行提取3次,得到玫瑰茄总黄酮提取量为40.2 mg/g,该值与预测值基本吻合,表明由Box-Behnken试验设计所得的最佳提取工艺条件科学合理,准确可靠。
2.5 玫瑰茄总黄酮回收率测定
表5 回收率测定结果Tab. 5 Results of recovery rate |
| 序号Number | 芦丁加入量 Amount of rutin/mg | 回收率 Recovery rate/% | 平均加标回收率 Average standard recovery rate/% | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.1 | 96.4 | 97.1 | |
| 2 | 0.2 | 97.1 | ||
| 3 | 0.3 | 97.8 | ||
2.6 玫瑰茄总黄酮抗氧化活性测定
3 讨论
福建省玫瑰茄资源非常丰富,除做蜜饯、果酱和果酒外,从中提取分离玫瑰茄总黄酮,可实现玫瑰茄综合利用,为玫瑰茄的开发利用和深加工开辟了一条新的途径。
超声波-微波协同提取是利用超声波的空化作用和微波的热效应,使超声波产生的振荡作用能有效弥补微波传热、传质不均等缺陷,微波极佳的热效应能有效地弥补超声波产热不足的问题[21]。本研究在单因素试验的基础上,采用Box- Behnken法设计试验优化玫瑰茄总黄酮的超声波-微波协同提取工艺。结果表明,最佳工艺条件为:乙醇浓度40%、液固比50:1 (mL/g)、提取时间20 min、微波功率250 W、超声波功率50 W、提取2次。在此条件下,玫瑰茄总黄酮提取量为40.2 mg/g。通过对提取方法稳定性和加标回收率的考察,确定该提取方法测定结果准确,建立的回归模型模拟良好。通过对比王丽岩等[8]超声波辅助提取玫瑰茄黄酮类化合物（提取时间45 min,得率3.78%）,得到超声波-微波协同提取玫瑰茄总黄酮不仅缩短提取时间,而且提取效率更高。
研究表明,自由基能杀死机体红细胞,降解蛋白质、细胞膜和多糖化合物,可引起许多疾病如机体衰老、诱发心脑血管疾病、糖尿病、痴呆症、肿瘤等的发生[9]。而植物黄酮类化合物可以抑制自由基反应,具有抗衰老、预防心血管疾病、减少癌症的发生。目前,食品中常用的人工合成抗氧化剂具有毒性,寻找安全、天然抗氧化剂已经成为趋势。植物黄酮类化合物是很好的天然抗氧化剂,对其研究已经引起研究人员广泛重视。陈红梅等[22]研究结果表明,半枝莲黄酮提取物具有一定抗氧化活性。张蜀艳等[23]研究结果表明,白花蛇舌草和半枝莲总黄酮具有较强的抗氧化性。抗氧化实验结果表明,玫瑰茄粗提物和纯化物都具有清除O2-•自由基和DPPH自由基能力,其清除能力与浓度呈较明显的量效关系,总黄酮质量浓度越高,清除能力越强,但纯化后总黄酮比粗提物总黄酮清除率强。当其浓度达1.4 mg/mL时,对O2-•自由基的清除率分别为77.5%和90.1%。当其浓度达1.4 mg/mL时,对DPPH自由基的清除为82.9%和87.4%,但都弱于维生素C。总之,黄酮类化合物作为广泛存在于玫瑰茄的一类活性药用成分,是一种很好的天然抗氧化剂,在抗衰老、减少痴呆症、癌症、预防心血管疾病、糖尿病的发生方面具有较好的功效。