原产于“一带一路”沿线南亚、东南亚等国家的杧果（Mangifera indica L.）有着“热带果王”的美誉,近年来我国杧果产业得到了长足发展,已成为热区重要的特色农业支柱产业之一,面积和产量分别位居世界第3位和第5位,但在品种选育、栽培管理、病虫害防治、采后保鲜加工等方面与上述原产国仍存在一定差距[1]。
由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz. & Sacc.）引起的杧果炭疽病是影响该产业健康发展的主要因素之一,该菌在细胞壁水解酶的协助下,主要借助芽管顶端产生的黑色素化的附着胞直接穿透寄主表皮侵入为害[2]。
漆酶是多铜氧化酶,在黑色素合成途径中起着重要作用。常以基因家族的形式广泛存在于植物病原菌,成员几个至十余个不等[3,4]。来自同一病原菌漆酶家族中不同成员的蛋白序列并不具有较强的保守性,功能差异较大。目前得到较为系统研究的是玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）漆酶基因家族,发现了9个漆酶成员StLAC1~ StLAC9,其中StLAC1、StLAC4、StLAC6属于漆酶亚家族1,StLAC2属于漆酶亚家族3[5,6]。StLAC1和StLAC2基因在黑色素合成、附着胞穿透力和分生孢子形成等方面具有重要作用[7]。StLAC1突变后黑色素合成受阻,菌落呈灰白色,生长速率减慢,不产生分生孢子,菌丝透明呈不规则状,菌丝末端能形成附着胞,但因膨压下降、侵染能力显著降低、渗透调节能力增强,漆酶、纤维素酶和果胶酶活性显著下降[8];与StLAC1不同之处,StLAC2突变后菌丝在玻璃纸上不能发育产生附着胞,长出的新菌丝只能在玻璃纸膜表面蔓延,不能穿透玻璃纸膜,无法侵入完整的玉米叶片,但能侵染刺伤的玉米叶片[9];在突变体ΔStLAC1中,StLAC1完全不表达,其他黑色素合成酶基因表达量与野生型无明显差异,而StLAC2表达量有所上调,起到了互补StLAC1的作用[5]。相反,番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici）的3个漆酶成员（lcc1、lcc3和lcc5）的缺失突变体对致病力均无影响,lcc1仅与氧化胁迫能力及漆酶酶活相关,lcc3仅与菌落生长速率、碳源利用、氧化胁迫以及对酚化合物的敏感性相关[10,11]。更有甚者,大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）的漆酶基因VdLac对菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成均不影响[12]。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株:胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害研究组提供。
1.2 方法
1.2.1 Cglac3基因序列特征 用Fungal gDNA Kit（BioMiga）和Fungal RNA Kit（Tiangen）提取总DNA和RNA,并用TIANScript cDNA First- Stand Kit将总RNA反转录为cDNA。参考橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01基因组中ID号为A08557的漆酶基因设计扩增Cglac3的引物（表1）。
表1 主要引物信息Tab. 1 Main primer information in the study |
| 目标片段 Target fragment | 引物名称 Primer name | 引物序列（5′-3′） Primer sequence (5′-3′) | 预期长度 Sequence length/bp | 退火温度 Annealing temperature/℃ |
|---|---|---|---|---|
| 5lac3 | 5lac3-F1 | CCGTCTGTCATCGTGGAGCAG | 1540 | 59.4 |
| 5lac3-R1 | TCGTTGGAAGAGCAGGTGAGC | |||
| 3lac3 | 3lac3-F1 | GATGACGCGACGTGCAGATAA | 1493 | 57.2 |
| 3lac3-R1 | TGAGGCTGGAAAGTCCTACCG | |||
| Rlac3 | Rlac3-F1 | CTCCTCTTCCCTGCCTTGACG | 1662 | 59.4 |
| Rlac3-R1 | GAGGGCGTAGGCGTTCCAGTT |
1.2.2 qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表达变化 参考吴秋玉等[15]的方法,用qRT-PCR分析Cglac3在杧果炭疽病菌侵染杧果叶片0、6、12、24、36、48、72 h过程中的表达,以及在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表达,确定Cglac3在侵染过程中的作用及其与漆酶基因LAC1、细胞壁水解酶外切葡聚糖酶基因CgCBH1之间的关系。
1.3 数据处理
采用DNAssist 1.0软件比对分析Cglac3基因DNA和cDNA的序列。采用Primer 5.0 TMHMM、SignalP 4.1 Server等软件分析Cglac3基因的序列特征。采用软件包ExPASy中Computer/MW软件分析蛋白序列。采用BioEdit软件对Cglac3基因的编码序列特征进行分析。采用SOPMA软件分析Cglac3基因的蛋白质二级结构。采用MEGA 7.0构建Cglac3基因编码蛋白系统进化树。
2 结果与分析
2.1 Cglac3基因DNA全长片段扩增
根据获得的Cglac3片段序列,以杧果炭疽病菌gDNA为模板,用引物5lac3-F1/R1、3lac3-F1/R1扩增获得了约1600 bp和1500 bp的片段（图1A）,测序拼接后全长为2797 bp,包括1842 bp编码区序列以及5°端和3°端非编码区466 bp和489 bp序列。与橡胶树炭疽病菌HBCg01菌株的参考基因（A08557）有46个差异位点,用DNAssist软件初步推测含有3个内含子,开放读码框大小为1731 bp。
2.2 Cglac3基因cDNA序列扩增获得
以杧果炭疽病菌gRNA为模板,用引物Rlac3- F1/R1扩增获得了约1700 bp的片段（图1B）,测序后与DNA序列拼接比对,发现了3个大小分别为56、51、58 bp的内含子和1个大小1677 bp开放读码框,符合GT-AT法则。其双链核苷酸分子量为1022.14 kDa,（G+C）含量为59.33%,（A+T）含量为40.67%,富含GC碱基。该序列已提交在GenBank,登录号为MN338057。
2.3 Cglac3基因预测蛋白的同源性以及预测蛋白的保守域分析
Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,SignalP 4.1 Server分析显示前19个氨基酸是信号肽序列。Cglac3蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50,是一种碱性蛋白质,富含极性氨基酸,二级结构中α-螺旋占12.72%,延伸链占27.78%,β-转角占7.53%,无规则卷曲占51.97%（图2）。
系统进化树聚类显示（图3）:Cglac3蛋白与C. fructicola extracellular dihydrogeodin oxidase gc5蛋白（XP_007273628.1）聚在同一分支上,相似性达94%,与C. gloeosporioides multicopper oxidase Cg-14（EQB50152.1）基因编码同源性也很高,相关性在90% 以上,与杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1、LAC2的亲缘关系较远。该结果表明Cglac3蛋白可能与茶树炭疽菌（C. fructicola）的oxidase类聚为一类,且与本课题组前期克隆自杧果炭疽病菌的漆酶基因LAC1和LAC2的亲缘关系较远。
图3 Cglac3蛋白与其他真菌漆酶蛋白的系统进化树系统进化树的命名由种名和基因名称、GenBank登陆号组成。分支上的数字是bootstrap值。Cglac3为黑色三角形标注。 Fig. 3 Phylogenetic tree of predicted protein Cglac3 and other fungal laccases The name of phylogenetic tree consists of the species name, the gene name and the landing number of GenBank. The number on the branch is bootstrap. Cglac3 is marked with a black triangle. |
利用NCBI的BLAST进行该基因保守结构域分析（图4）,发现Cglac3蛋白中含有Cu-oxidase-3保守结构域和多个Cu+结合位点,表明Cglac3基因是一种含铜的氧化酶（multicopper oxidase）,本研究获取Cglac3是漆酶基因。
2.4 qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表达变化
表2 Cglac3在杧果炭疽病菌侵染叶片过程中的表达变化Tab. 2 Expression of Cglac3 gene in process of C. gloeosporioides infecting leaves |
| 项目 Item | 时间/h | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 6 | 12 | 24 | 36 | 48 | 72 | |
| 相对表达量 | 1.00Gg | 11.22Cc | 15.03Aa | 8.56Ff | 9.67Ee | 12.79Bb | 10.36Dd |
Note: Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01), and different lowercases represent significant difference (P<0.05). | |
注:不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）,不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 |
与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突变体中下降了74%（0.26）,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1缺失敲除突变体中下降了56%,均达到显著差异, LAC1的表达与Cglac3表现一致,也显示出下降（下降了68%）（图5B）,表明LAC1调控Cglac3的表达,Cglac3和Cglac1的表达均受外切葡聚糖酶基因CgCBH1的影响。
3 讨论
漆酶是一种糖蛋白,由肽链、糖配基和Cu2+三个部分组成,来源不同的漆酶其氨基酸序列相似性不高,但在铜原子结合区域的保守性相当髙[14]。玉米大斑病菌漆酶基因家族中的9个成员StLAC1~ StLAC9,编码550~613个氨基酸,相似性仅为19.79%~48.70%,StLAC1、StLAC4和StLAC6属于漆酶亚家族1,StLAC2属于漆酶亚家族3,但互补作用不仅存在于StLAC1、StLAC4和StLAC6之间,也在StLAC1和StLAC2之间存在[4, 9]。杧果炭疽病菌中的漆酶基因LAC1编码590个氨基酸[16],LAC2编码594个氨基酸[17],本研究Cglac3编码558个氨基酸,进化树显示3个成员之间同源性很低,分别聚在不同分支上,可能属于不同亚家族。根据LAC1和Cglac3在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突变体和外切葡聚糖酶基因敲除突变体中表达推测,LAC1和Cglac3之间表达变化步调一致,可能存在协同作用,这与玉米大斑病菌中漆酶基因StLAC1和StLAC2之间的互补作用截然不同。
DHN黑色素合成途径上有6个酶,漆酶是最后一步将1,8-二羟基萘（DNH）氧化形成黑色素的酶,理论上应该只影响黑色素的合成,与其他侵染相关的细胞壁降解酶如外切葡聚糖酶无关,但本研究发现CgCBH1缺失后,LAC1和Cglac3的表达显著下降,反馈性抑制了漆酶的表达。类似的现象在漆酶基因LAC1和果胶裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3之间也存在[18]。
本研究分析了Cglac3基因的结构和功能,并通过qRT-PCR分析Cglac3在侵染过程中及其在突变体ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表达变化,本研究结果显示,已从杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌中克隆出Cglac3漆酶基因,Cglac3基因的全长cDNA的序列为1667 bp,开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa。Cglac3在杧果炭疽病菌侵染寄主的过程中发挥着重要作用,尤其在侵入后表达最高,是接触初期的15倍。前期研究在杧果炭疽病菌中已发现漆酶家族成员12个,其中LAC1的功能已被敲除鉴定,主要调控分生孢子的产生、菌丝生长、发育、黑色素沉着、漆酶和细胞壁降解酶的产生以及致病力。本研究结果显示Cglac3与LAC1同源性很低,它与LAC1有何功能异同点或与其他漆酶基因是否有协同或互补作用有待进一步的研究,该研究结果为后续鉴定其功能打下了基础,有助于更加全面地了解漆酶基因家族在C. gloeosporides的分子致病机制,也能为未来设计新的杀菌剂提供理论依据。