辣木（Moringa oleifera Lam）,又称鼓槌树,属辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa）多年生乔木,原产于印度和非洲,辣木科仅有1属14种[1,2]。辣木含有丰富的纤维、维生素、矿物质、蛋白质、氨基酸、多糖、辣木素、皂苷、酚类和活性酶类等成分,具有消炎、抑菌、降血糖、降胆固醇、凝血、抗氧化、抗肿瘤和癌症等功能[3,4]。因此,辣木又被誉为“神奇之树”和“母亲最好的朋友”。很多发展中国家利用辣木来改善儿童营养不良,辣木具有食用、园林造景、工业、药用等多种用途[5]。
染色体核型分析技术能明确识别各个染色体的特征,有助于基因定位的研究,它是细胞遗传学的一项基本技术,也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学一个不可缺少的手段[6,7]。目前,辣木细胞学上的研究仅局限于辣木染色体数量和倍性的研究。Puri等[8]以印度多油辣木材料的小孢子发育,观察到二倍体染色体数2n=28;张洁等[9]以多油辣木栽培品种‘PKM1’的茎尖为材料,同样得出二倍体染色体数2n=28;Mendioro等[10]以花蕾为材料,也得出二倍体染色体数2n=28;魏静[11]和向素琼等[12]均以辣木茎尖为材料,均确定辣木为二倍体,染色体数2n=28,初步得出染色体长度和染色体组总长度。但最后均未能得到臂比、着丝点位置、核型的不对称程度和核型公式等核型指标,进而进行核型分析。至今,有关辣木染色体核型分析的研究未见报道。为此,本研究对辣木染色体制片技术进一步优化,并进行核型分析研究,摸索出成熟的辣木染色体制片技术,得出辣木的核型公式和不对称程度,为辣木的起源、演化及遗传育种提供一定的理论依据和技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为印度辣木的茎尖和嫩叶,采自广东省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心实验基地。
1.2 方法
1.2.1 取材和预处理 于上午9:00—11:00取健壮的新枝茎尖,长度小于3 mm的幼叶（以下简称小叶）以及长度在3~8 mm幼叶（以下简称大叶）,分别置于0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h。清水冲洗后转入卡诺固定液[无水乙醇-冰乙酸（3:1,V/ V）],固定24 h,再用70%乙醇4 ℃冰箱保存备用。
取大量健壮茎尖,采用以下（表1）预处理方法,进行预处理梯度实验。清水冲洗后转入卡诺固定液[无水乙醇-冰乙酸（3:1,V/V）],固定24 h,70%乙醇4 ℃冰箱保存备用。
表1 茎尖预处理方法Tab. 1 Different pretreatments on the stem tips |
| 处理编号 Treatment No. | 预处理试剂 Pretreatment reagent | 预处理温度 Pretreatment temperature/℃ | 预处理时间 Pretreatment time/h |
|---|---|---|---|
| 1 | 8-羟基喹啉 | 黑暗、25 | 2.0 |
| 2 | 8-羟基喹啉 | 黑暗、25 | 2.5 |
| 3 | 8-羟基喹啉 | 黑暗、25 | 3.0 |
| 4 | 对二氯苯 | 黑暗、25 | 1.5 |
| 5 | 对二氯苯 | 黑暗、25 | 2.0 |
| 6 | 对二氯苯 | 黑暗、25 | 2.5 |
（1）先把材料置于蒸馏水前低渗30 min;（2）再置于5%纤维素酶和4%果胶酶混合液中,在37 ℃中酶解2、3、4、5 h;（3）吸取酶液,加入蒸馏水后低渗30 min;（4）吸取蒸馏水,滴加临时配制的固定液[3（乙醇）:1（冰乙酸）]后固定15 min;（5）涂片,载玻片上先滴3滴固定液,夹取少量茎尖组织或叶片边缘组织,迅速涂抹在载玻片上,且在火焰上迅速烘烤;（6）染色,用吉姆萨染色15 min,冲洗玻片干燥后再镜检。
臂比(r)=长臂(S)/短臂(L)
染色体相对长度=染色体长度/染色体组总度×100%
染色体相对长度系数(I. R. L)=每条染色体相对长度/染色体平均相对长度
平均长度核型不对称系数(As. k)=长臂总长/全组染色体总长×100%
2 结果与分析
2.1 辣木染色体制片技术优化
2.1.1 不同取材部位对中期细胞比率和形态的影响 从表2可知,不同取材部位对中期细胞数目和形态的影响均较大。3种材料中期细胞所占比率分别为茎尖22.6%、小叶14.3%、大叶5.4%;适合核型分析的中期细胞比率为茎尖18.2%、小叶7.8%、大叶1.3%。由此可见,茎尖所含的中期细胞比率明显大于小叶和大叶的。由于茎尖是分生组织,新陈代谢快,细胞活动最活跃,中期分裂相最多;小叶边缘组织的新陈代谢又比大叶的快,分裂相也明显比大叶多。从中期细胞的形态来看,茎尖细胞大,细胞质稀薄,背景干净,且染色体也较分散,更有利于细胞的核型分析。结合中期细胞的数量和细胞形态可判断,茎尖可作为最佳的取材部位,辣木全年生长,新枝茎尖多,取材方便。
表2 不同取材部位对辣木中期细胞的影响Tab. 2 Effect of sampling parts on metaphase of M. oleifera |
| 取材部位 Sampling position | 中期细胞所占比例 Proportion of metaphase cells/% | 适合核型分析的中期细胞比率 Ratio of the metaphase cells suitable for the karyotype/% | 中期细胞形态 Morphology of metaphase cell |
|---|---|---|---|
| 新枝茎尖 | 22.6 | 18.2 | 细胞大,细胞质稀薄,染色体分散 |
| 小叶 | 14.3 | 7.8 | 细胞较小,染色体较分散 |
| 大叶 | 5.4 | 1.3 | 细胞小,细胞质厚,染色体不分散 |
2.1.2 不同预处理方法对染色体制片效果的影响 6种不同预处理方法对辣木茎尖处理的结果（图1,表3）表明,不同预处理方法对中期细胞数目,染色体分散效果及清晰度都有一定的影响。饱和对二氯苯比8-羟基喹啉所得的中期细胞比率要高,饱和对二氯苯处理2 h的中期细胞比率为24.5%,明显高于其他处理组（表3）。其相对应的处理效果也最好（表3,图1B2）,染色体分散,聚缩,形态清晰,可见溢痕,很适合染色体核型分析。其次是8-羟基喹啉预处理2.5 h（图1A2）,染色体分散,聚缩,形态清晰。而饱和对二氯苯处理1.5、3 h和8-羟基喹啉处理2、3 h（图1A1,图1A3,图1B1,图1B3）,效果均不理想,染色体形态较模糊,不利于核型分析。
图1 辣木在不同预处理中的中期细胞图A1~A3分别表示用8-羟基喹啉预处理2.0、2.5、3.0 h;B1~B3分别表示用饱和对二氯苯预处理1.5、2.0、2.5 h。 Fig. 1 Mtaphase cell of M. oleifera in different pretreatment A1-A3: 8-hydroxyquinoline pretreat for 2.0, 2.5, 3.0 h; B1-B3: p-dichlorobenzene pretreat for 1.5, 2.0, 2.5 h. |
表3 不同预处理方法对辣木染色体的影响Tab. 3 Effect of different pretreatment methods on chromosome of M. oleifera |
| 处理Treatment | 中期细胞所占比例Proportion of metaphase cell/% | 染色体分散效果及清晰度Dispersion and distinguish degree of chromosome |
|---|---|---|
| 1 | 9.4 | 不够分散聚缩,形态欠清晰。 |
| 2 | 20.3 | 分散性良好,形态清晰,聚缩。 |
| 3 | 11.2 | 分散,形态模糊,有拖尾现象。 |
| 4 | 10.7 | 不够分散聚缩,形态不清晰。 |
| 5 | 24.5 | 分散性好,形态清晰,聚缩,可见溢痕。 |
| 6 | 16.1 | 分散,形态模糊,有拖尾现象。 |
2.1.3 不同酶解时间对染色体制片效果的影响 从不同酶解时间对制片效果的影响可知（表4）,酶解时间对染色体分散效果及清晰度影响较大,特别是细胞背景的干净程度。最适合的酶解时间是4 h,此时细胞背景干净,染色体分散性良好,形态清晰,最适合核型分析。酶解2、3 h的细胞背景和染色体形态不够理想;酶解5 h细胞极易破裂,造成染色体丢失。
表4 不同酶解时间对制片效果的影响Tab. 4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on microscopical preparation |
| 酶解时间Enzymatic time/h | 染色体分散效果及清晰度 Dispersion and distinguish degree of chromosome |
|---|---|
| 2 | 细胞质浓厚,染色体易重叠,形态不清晰,分散不好 |
| 3 | 细胞质稀薄,染色体较分散,形态清晰 |
| 4 | 细胞质稀薄,染色体分散性良好,形态清晰,可见溢痕 |
| 5 | 染色体分散,形态清晰,但细胞易破裂,染色体易丢失 |
2.2 辣木核型分析
2.2.1 染色体数目 辣木染色体数目为2n=28,为二倍体。
表5 辣木染色体核型参数Tab. 5 Parameters of chromosome karyotype of M. oleifera |
| 染色体编号 Serial number | 染色体相对长度Relative length/% | 相对长度系数值 Relative length index | 臂比值（长/短）Arm ratio(L/S) | 染色体类型Type | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 长臂Long arm | 短臂Short arm | 全长Total length | ||||
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 | 7.65 6.75 6.75 5.94 4.11 3.81 3.46 3.55 3.01 2.74 2.75 2.79 2.66 2.47 | 6.70 5.05 4.11 4.04 3.19 2.99 2.49 2.33 1.81 1.86 1.83 1.78 1.59 1.49 | 14.35 11.80 10.86 9.98 7.30 6.80 5.95 5.88 4.82 4.60 4.58 4.57 4.25 3.96 | 2.016 1.658 1.526 1.402 1.026 0.955 0.836 0.826 0.677 0.650 0.643 0.642 0.597 0.556 | 1.41 1.37 1.64 1.48 1.29 1.27 1.39 1.52 1.66 1.48 1.50 1.57 1.67 1.66 | m m m m m m m m m m m m m m |
3 讨论
3.1 辣木染色体制片技术
染色体制片技术是核型分析、基因定位等细胞学研究的基础。不同物种在取材、预处理、解离和制片方法上有较大差异,取材部位、预处理方法和解离方式的选择直接关系到制片的质量。本研究首次报道辣木染色体的核型分析结果并优化制片技术,获得清晰的中期细胞。而前人[11,12]只报道了染色体数目,因辣木染色体不清晰和本身是小染色体的限制,较难进行有效的核型分析。本研究认为嫩枝茎尖是较佳取材部位;叶片次之,且小叶片较大叶片效果好。这与茎尖分生组织多,新陈代谢快,细胞分裂快且周期短有关。顾蔚等[20]也发现,华中五味子茎尖中期细胞明显比叶片多,是较理想的取材部位。Mendioro等[10]和魏静[11]以辣木花蕾、根尖为材料也获得了较佳的中期细胞,但未能进行核型分析。但辣木茎尖相对花蕾和根尖来说取材方便,不受花期影响,也不用单独培养根尖。
3.2 辣木染色体数目及核型特征
一般认为,核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的,系统演化上处于比较古老和原始的植物,大多具有较对称的核型,而不对称的核型常见于衍生、特化以及比较进化的植物类群中。核型不对称系数越接近50%,核型的对称程度越高,进化程度越原始。而辣木的核型不对称系数60.29%,接近于50%,具有较大的对称性,核型为1B型,表明辣木在进化类型上可能属于原始类型。本研究为辣木的起源、演化及遗传育种提供一定理论依据。