随着转录组技术在复杂生物学过程、代谢途径及逆境生理胁迫等相关研究中的广泛应用,实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）成为生物学中研究基因定量表达最常见、简单、快速的方式之一,具有高灵敏性和特异性,被广泛应用于分子医学、食品安全检测和病虫害防治[1,2]。qRT-PCR对样本的RNA和cDNA的质量、完整性、引物特异性、扩增效率以及内参基因的选择具有较严格的要求。内参基因（reference genes）是指在细胞中能够稳定表达的一类基因,是细胞基本转录组的成分之一,它参与维持细胞的基本功能。内参基因的基本功能是消除不同样品间RNA的提取质量、反转录效率等对定量表达分析造成的偏差,起到校正的作用[3]。因此,随着基因表达的深入研究,选择合适的内参基因是保障实验分析结果准确性的重要前提[4]。目前,在真菌中常用的内参基因包括肌动蛋白（actin）、泛素（ubiquitin,UBQ）、18S核糖体RNA（18S rRNA）、微管蛋白（tubulin beta,TUB）和翻译延长因子（translation elongation factor,TEF）等。然而,内参基因的转录水平随着生物体发育阶段和实验条件的变化而有所差异[5,6],在研究过程中,若选择不能稳定表达的内参基因,将对实验结果的准确性产生巨大影响。
牛樟芝（Antrodia cinnamomea）为台湾地区常见药用菌,又名樟芝、樟菇、牛樟菇、红樟芝,属担子菌门（Basidiomycota）、薄孔菌属（Basidiomycetes）[7]。牛樟芝仅生在中国台湾保育树种牛樟树（Cinnamomum kanehirai Hay）中空的树干内部或腐烂的树干表面[8]。近年来,随着对牛樟芝分子生物学研究的不断深入,qRT-PCR技术成为重要研究手段之一,而选择表达高效、稳定的内参基因是开展qRT-PCR的关键。目前,对于牛樟芝内参基因的研究报道较少,本研究选取3种不同阶段牛樟芝菌丝体,利用qRT-PCR技术筛选来自牛樟芝转录组数据的8个候选内参基因,采用geNorm[9]、NormFinder[10]和BestKeeper[11]软件进行基因的稳定性评估,从而选择稳定表达的内参基因,为其后续基因表达研究、转录组数据分析提供更可靠的参考和校正依据。
1 材料与方法
1.1 材料
牛樟芝菌株由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心菌种保藏室提供。将菌种接种到PDA培养基上进行活化,然后转移至牛樟芝液体培养基,置于120 r/min摇床,在28 ℃黑暗培养7、21、35 d,然后收集菌丝体备用[12]。
1.2 方法
1.2.1 牛樟芝总RNA提取及cDNA合成 参照全式金生物公司的Trizol试剂盒说明书步骤提取牛樟芝菌丝体的总RNA,每个样品设置3次重复,采用NanoDrop 2000对提取的总RNA浓度和质量进行检测,合格后置于-80 ℃保存备用。
参照艾德莱生物科技公司的TRUEscript RT Master Mix试剂盒说明书步骤进行cDNA合成,每20 μL体系中含有500 ng总RNA样品。将合成后的cDNA置于-20 ℃保存备用。
表1 牛樟芝候选内参基因及其引物序列Tab. 1 Primer sequences of selected reference genes for A. cinnamomea |
| 基因名称 Gene name | 引物序列（5°-3°） Primer sequences (5°-3°) | Genbank accession No. |
|---|---|---|
| 肌动蛋白 (Actin) | F: TATTCTCGTCTCATGGCCTTTC R: GTCGCAGCTGGAGTTGATTA | MK968953 |
| 酪氨酸激酶(TPK) | F: CATGTCAGGCTCCAACGATAA R: GAGGACAAGTCCACGAGAAAG | MK968954 |
| 二氢尿嘧啶核苷(Floxuridine) | F: AGACGCCCACAACAACTAAA R: TAGTCTCGGCGGACATAAGA | MK968955 |
| CAP甘氨酸(CAP-Gly) | F: ACGTTCTGAGAGGCGATTTG R: GCATGCCAGTAGTGGGATTTA | MK968956 |
| α水解酶(α-Amylase) | F: CGACACCCAAGAGTAAGAGAAG R: CCGGTTTGACTTGTGGATTTG | MK968957 |
| 磷酸酯酶(Phosphatase) | F: ACCAGATTGTTGACCGTTACTC R: GCTAATGTTGGTGGCGTTATTG | MK968958 |
| HA2解旋酶(HA2- helicase) | F: CACCAGATCGGCACAGTAAA R: GAATGGAGGATGGCCGTAAA | MK968959 |
| Mg2+转运蛋白(MAGT1) | F: CATGTCAGGCTCCAACGATAA R: GAGGACAAGTCCACGAGAAAG | MK968960 |
1.2.3 实时荧光定量PCR 按照全式金生物公司的SYBR TransStart实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行反应,反应在Bio Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行。反应总体系为20 μL:总cDNA模板1 μL,正反引物各1 μL（10 μmol/L）,2×SYBR qPCR Mix 10 μL,ddH2O补足至20 μL,每个样品3次重复。qRT-PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性5 s,52~55 ℃退火20 s,40个循环,在延伸阶段采集荧光信号,反应结束后增加60~95 ℃熔解曲线分析。
1.2.4 扩增效率分析与标准曲线绘制 取3个cDNA样品等量混合后,按10倍依次稀释6个梯度作为模板,每个反应3个重复。熔解温度通过PCR仪计算得到,根据所得的Ct值绘制标准曲线,然后计算标准曲线方程,从而得出斜率（k）、线性相关系数（R2）、扩增效率（E）。
1.3 数据处理
利用PCR仪统计Ct值,根据公式Q=2-ΔΔCt计算各样品的相对表达量Q,其中ΔCt=Ct(样品)- Ct(min),Ct(min)为所有样品中最低的Ct值。根据8个内参基因在牛樟芝菌丝体3个发育阶段的相对表达量,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件分别计算内参基因的稳定值,比较并确定适宜的内参基因。
2 结果与分析
2.1 引物扩增效果及特异性分析
表2 候选内参基因扩增效率及相关参数Tab. 2 Parameters of standard curves of selected reference genes |
| 基因名称Gene name | 熔解温度Melting temperature/℃ | 斜率（k） Slope (k) | 线性相关 系数（R2） Linear correlation coefficient (R2) | 扩增效率（E）Amplification efficiency (E)/% |
|---|---|---|---|---|
| Actin | 53 | 3.103 | 0.984 | 90.9 |
| TPK | 54 | 3.515 | 0.925 | 92.5 |
| Floxuridine | 52 | 3.142 | 0.996 | 92.5 |
| CAP-Gly | 52 | 3.517 | 0.994 | 92.5 |
| α-Amylase | 55 | 3.241 | 0.996 | 96.6 |
| Phosphatase | 53 | 3.689 | 0.990 | 86.7 |
| HA2- helicase | 52 | 3.145 | 0.995 | 92.6 |
| MAGT1 | 54 | 3.526 | 0.997 | 92.1 |
2.2 内参基因表达丰度分析
由于Ct值的变化与内参基因的表达水平有密切关系。Ct值越高,其表达量越低,其表达丰度越低;反之,表达丰度越高。对8个内参基因在发酵时期进行表达丰度分析,发现随着培养时间的增长,Actin和CAP-Gly表达丰度不随培养时间的增长而增加,而其他候选内参基因均随培养时间的增长表达丰度变高（图3）。
2.3 geNorm软件对内参基因的稳定性评价
2.4 NormFinder软件对候选内参基因的稳定性评价
表3 NormFinder对候选内参基因的稳定分析Tab. 3 NormFinder analysis of candidate reference genes with respect to the expression stability |
| 基因名称Gene name | 稳定值Expression stability values |
|---|---|
| Actin | 0.970 |
| TPK | 0.204 |
| Floxuridine | 0.573 |
| CAP-Gly | 0.465 |
| α-Amylase | 1.626 |
| Phosphatase | 1.267 |
| HA2- helicase | 0.640 |
| MAGT1 | 1.810 |
2.5 BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性评价
BestKeeper软件根据Q-PCR的Ct值计算各个基因的相关系数（r）、标准偏差（SD）、变异系数（CV）等,通过比较值的大小来分析内参基因的表达水平;标准偏差（SD）>1,则内参基因的稳定性差,不可以用作内参基因;相关系数（r）值越低,其稳定性越高。软件分析得到的结果如表4所示,根据BestKeeper软件计算原理可知HA2-helicase的表达水平最好,其次是TPK和MAGT1。
表4 BestKeeper软件分析内参基因的表达稳定值Tab. 4 BestKeeper analysis of candidate reference genes with respect to the expression stability |
| 参数Parameter | Actin | TPK | Floxuridine | CAP-Gly | α-Amylase | Phosphatase | HA2-helicase | MAGT1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 相关系数r | 0.935 | 0.944 | 0.895 | 0.852 | 0.962 | 0.978 | 0.925 | 0.989 |
| 标准偏差SD | 1.60 | 0.98 | 1.25 | 1.33 | 1.10 | 1.12 | 0.93 | 1.05 |
| 变异系数CV | 3.04 | 1.97 | 2.38 | 2.51 | 2.15 | 2.17 | 1.90 | 2.07 |
3 讨论
随着生物技术的高速发展和推广应用,qRT- PCR技术由于其特异性强、灵敏度高和重复性好已成为各行业、各领域广泛用于基因表达研究的技术之一[14]。内参基因在qRT-PCR技术应用过程中作为参考、对照基因具有重要作用,选择合适的内参基因是检测基因表达水平变化时的重要参照物。理想的内参基因所具有的特点包括,应在所有组织和细胞类型中都能稳定表达,且不受外界环境及组织形态的影响[15],其作用是矫正了qRT-PCR操作过程中的操作误差,从而保证了实验结果的稳定性和准确性。本研究通过前期实验结果,系统筛选和分析了Actin、TPK、Floxuridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2- helicase和MAGT1等8个候选内参基因在牛樟芝不同培养阶段牛樟芝菌丝体中的表达结果,经geNorm、NormFinder、BestKeeper等常用内参基因分析软件对结果进行评估,其中geNorm软件筛选得到的最适合的内参基因为Floxuridine、HA2-helicase、TPK;NormFinder软件筛选得到的最适合的内参基因是TPK、CAP-Gly、Floxuridine、TPK;BestKeeper软件筛选得到的最适合的内参基因是HA2-helicase、TPK、MAGT1。由于3种软件的分析计算方法不同,其结果也略有不同[15,16],该现象也广泛存在于其他物种的内参基因研究中[17,18,19,20]。综合分析各评估结果,认为TPK和HA2- helicase适合作为牛樟芝菌丝体qRT-PCR研究中的内参基因。酪氨酸激酶（PTKs）基因家族是生物体信号网络的核心组分,是在细胞通讯、细胞黏附、细胞增殖和信号转导过程中起到关键作用的一类生长因子,具有能促进生长因子信号转导、参与细胞生长、增殖、分化等功能。在目前已报道的研究中,并未发现该基因作为内参基因的报道,但在研究其基因家族差异进化的过程中,发现PTK经历了更显著的规模化扩张和成员基因间的功能分化,组织表达分化更明显,催化更特异的底物发生磷酸化,参与特异的差异进化作用[21]。通常在多数作物中,Actin和tubulin作为常见的内参基因,韩晓雪等[22]利用geNorm和NormFinder软件分析得到Actin可以作为番茄基因表达中的内参基因;在对日本沼虾的研究中发现,在缺氧条件下筛选得到的β-act是最稳定的内参基因[23];Gopalam等[24]研究认为在盐胁迫条件下,Actin、EF1α、18S等在红树中能稳定表达。在本研究中,采用3项软件进行评估,结果表明Actin在牛樟芝菌丝体中的表达呈一定的波动性和不稳定性,不能作为最适合的内参基因。由此可见,内参基因的表达相对稳定性存在于特定物种和特定细胞中,因此,需要根据不同实验条件和样品状态筛选合适的内参基因。
目前,常用的内参基因评价软件包括geNorm、NormFinder和BestKeeper[25],本研究利用这3种评价软件所分析的结果趋势基本相同,略有差异,因为3种评价软件对于内参基因的选择都是依据Ct值设计的,但计算原理和方法均有不同,结果也会有一定差异[16]。geNorm软件在对内参基因的评价过程中不用考虑其他内参基因结果来判定合适的内参基因[9, 26],而NormFinder软件需要考虑其他内参基因再选择合适的内参基因[10];BestKeeper软件不但能分析内参基因的稳定性,还能比较目的基因的表达水平[11]。因此,在实际应用过程中,需要充分考虑程序的适用性和特点,确保内参基因筛选结果的准确性,降低实验误差。