甘薯因具有营养丰富、适应性广等优点大面积种植于热带、亚热带地区[1],是世界第七大主粮作物（FAO,2018）。甘薯属植物约有800~900个种,其中有二倍体、四倍体和六倍体等不同倍性的物种资源,且许多野生种具有优良的抗性基因[2,3]。基因组特征研究是植物基因资源开发、利用的前提。基因组大小、重复序列比例、杂合率和GC含量等参数会影响基因组的拼接组装过程[4]。基因组大小是指物种单倍体所含的DNA量,是表征生物基因组多样性的基本参数[5]。目前测定基因组大小的方法很多,流式细胞法（Flow cytometry,FCM）因其快速、准确的特点而被广泛应用[6],超过80%的物种都是采用该方法进行基因组大小测定[7],如枣、月季、草莓、灵芝[8,9,10,11]等。近年来,采用低深度测序后进行K-mer分析也是常用方法之一[12]。通过低深度高通量测序（Survey分析）判断基因组大小及复杂程度,以此选择合适的后续测序方案,从而增加测序的准确性[13]。
由于倍性复杂,甘薯遗传基础薄弱,导致甘薯的物种起源和基因组学研究落后于其他主要农作物[14]。近年来甘薯基因组研究逐渐兴起,然而甘薯属多数物种仍缺乏基本的基因组信息。Ipomoea cordatotriloba是甘薯组与栽培甘薯亲缘关系较近的13个物种之一,对研究甘薯亲缘关系及物种起源具有重要意义。本研究利用流式细胞术和染色体计数法,结合高通量测序技术,对I. cordatotriloba的基因组大小、倍性及基因组特征进行评估,为下一步全基因组测序提供参考并为甘薯野生资源利用提供支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
Ipomoea cordatotriloba（PI 518495）引自美国国家种质资源库,来源地为墨西哥Tabasco州。用已知基因组大小的大豆Williams 82（1 C= 1127 Mb[15]）作为内参。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞术 将搜集的野生种种子浸种催芽之后置于25 ℃的温室内生根,于1~2 d后取200 mg根尖进行实验;参照Peggy Ozias-Akins[16]的实验方法,取样后用蒸馏水洗净、晾干,放入预冷的无菌培养皿中,加入预冷4 ℃的改良硫酸镁裂解液600 μL。材料须浸没在裂解液中,用一次性灭菌刀片在一分钟内快速切碎该组织;用38 μm筛网过滤到1.5 mL EP管中;以2000 r/min离心6 min,弃上清液;加入200 μL PI染液（含浓度为50 μg/mL的RNase酶）置于4 ℃冰箱避光染色15 min,添加染料后震荡EP管;最后用BD公司C6流式细胞仪收集10 000个事件,重复测定3次。通过公式（1）计算基因组大小[17]（单位用pg或Mb来表示,两者间的换算关系为1 pg=978 Mb[18]）。
$\begin{matrix} & \text{sample}\ 1\ C\ \text{value}\ (\text{DNA}\ \text{pg}\ or\ Mb)= \frac{\text{mean}\ \text{of}\ \text{the}\ \text{G1}\ \text{sample }\ \text{peak}}{\text{mean}\ \text{of the G1 reference peak}}\times \text{reference1}\ C\text{ value} \\ \end{matrix}$
1.2.2 染色体压片 参照杨慧娴等[19]的方法,取I. cordatotriloba新鲜1 cm根尖于8-羟基喹啉中处理2~3 h,经蒸馏水洗净后转移至卡诺固定液中,24 h后于70%酒精中保存备用。实验时,取出根尖先用无菌水冲洗2~3次,再用柠檬酸冲洗2次,吸干柠檬酸后加入200 μL 2%纤维素酶和1%果胶酶的混合酶液进行酶解。切取根尖于载玻片上,用滤纸吸走多余水分,取干净的镊子轻轻敲打根尖。制片成功后加DAPI染色,于荧光显微镜下观察并拍照。
${{C}_{\text{base}}}={{C}_{\text{K-mer}}}\times L/(L-K+1)$
$G=\frac{{{n}_{\text{K-mer}}}}{{{C}_{\text{K-mer}}}}=\frac{{{n}_{\text{base}}}}{{{C}_{\text{base}}}}$
$\varphi =\frac{\alpha_{1/2}\times n_{K\text{species}}/(2\times K)}{n_{K\text{species}}-\alpha_{1/2}\times n_{K\text{species}}/2}=\frac{\alpha_{1/2}}{K\text{2-}\alpha_{1/2}}$
1.2.4 基因组初步组装 通过被reads截断的更小序列片段之间的重叠关系构建de Brujin图,去掉测序错误造成的分支,随机选择少量杂合位点并合并。将简化后的de Brujin图的每个分叉位点的序列截断,即为最初的Contigs。再将reads和Contigs进行比对,将Contigs组装成Scaffolds。
2 结果与分析
2.1 流式分析结果
表1 Ipomoea cordatotriloba基因组大小测定Tab. 1 Estimation of Ipomoea cordatotriloba genome size by flow cytometry |
| 样品 Sample | 内参 Internal standard | 变异系数 Coefficient of variation/% | 基因组大小 Genome size/Mb |
|---|---|---|---|
| I. cordatotriloba | 大豆 | 4.50±0.36 | 539.69±13.76 |
2.2 染色体压片结果
通过染色体压片计数法,确定I. cordatotriloba的倍性。DAPI染液只对染色体进行特异性染色,杂质无法被染色,因此较易判断染色体的轮廓,背景干净,计数较方便。I. Cordatotriloba染色体形态清晰,呈长棒状,分散良好,粘连现象较少,存在拖尾现象但不影响计数（图2）。通过观察10个细胞的分裂相,染色体数目均为30条,由于甘薯属植物染色体基数x=15,从而获知I. cordatotriloba为二倍体。
2.3 基因组survey分析结果
2.3.1 测序产出数据统计 对经过Illumina高通量测序技术得到的数据进行严格过滤,得到24.46 Gb的有效数据用于K-mer分析。由表2可知,测序质量≥20的碱基比率为97.01%,测序质量≥30的碱基比率达到92.05%,说明I. cordatotriloba基因组的测序质量较高。
表2 测序产出数据统计Tab. 2 Statistics of sequencing output data |
| 样品 Sample | 信息 数据库 Information database | 原始 数据 Raw data/Gb | 有效 数据 Clean data/Gb | Q20 比例 Q20 ratio/% | Q30 比例 Q30 ratio/% | GC含量 GC content/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| I. cordatotriloba | DES01489 | 25.71 | 24.46 | 97.01 | 92.05 | 38.10 |
表3 Ipomoea cordatotriloba基因组特征统计情况Tab. 3 Statistics of I. cordatotriloba genome characteristics |
| K-mer | K-mer数量 K-mer number | K-mer深度 K-mer depth | 基因组大小 Genome size/Mb | 修正后基因组大小 Revised genome size/Mb | 杂合率Heterozygous ratio/% | 重复序列比率 Repeat sequence ratio/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 17 | 18 867 813 720 | 33 | 571.75 | 560.70 | 0.40 | 57.93 |
2.3.3 基因组组装结果分析 K-mer值取41时可得到最优的拼接效果。将24.46 Gb有效数据进行拼接,分别得到978 566条Contigs和961 850条Scaffolds;由表4可知,I. cordatotriloba经组装后得到Contigs总长度为466 005 979 bp,占基因组大小的81.3%,其中最长为67 068 bp。Scaffolds总长度为467 229 510 bp,占基因组大小的81.5%,最长为67 068 bp。
表4 基因组组装结果统计Tab. 4 Statistics of outcome of genome assembly |
| 项目 Item | 总长度 Total length/bp | 总数量 Total number | 最大长度 Max length/bp | N50/bp | N90/bp |
|---|---|---|---|---|---|
| Contigs | 466 005 979 | 978 566 | 67 068 | 2 488 | 144 |
| Scaffolds | 467 229 510 | 961 850 | 67 068 | 2 818 | 145 |
3 讨论
基因组大小是分析种群进化、物种分类和生态学等领域研究的重要参照[21]。本研究通过对I. cordatotriloba基因组大小进行测定,为探究甘薯近缘野生种的基因组学信息提供参考。张志珂等[22]用萝卜、大豆、番茄做外参,通过流式细胞术估算‘解放钟’枇杷基因组大小为654.399 Mb,与测序得到的结果773 Mb有较大的差异,误差达15.3%。Bennett等[23]以新杆状线虫和果蝇作为内标测得拟南芥的基因组大小为157 Mb,与早期测序得到的125 Mb也存在较大差异,误差为基因组大小的25.6%。本研究以Williams 82大豆为内参,通过流式细胞仪测定I. cordatotriloba的基因组大小为(539.69±13.76)Mb。基于K-mer分析得到的I. cordatotriloba的基因组大小为560.70 Mb,与流式细胞术得到的结果误差仅为3.7%,说明2种测定方法得到的结果较为接近。前人研究表明I. cordatotriloba是四倍体,基因组大小为3.3 pg/2C[16],与本研究得出的基因组大小差异较大。随着科学技术的发展,现代的流式细胞仪器更先进,准确性更高,且本研究根据染色体计数得出I. cordatotriloba为二倍体,结合survey预估的数据认为本研究的结果更为准确。
植物基因组杂合受到品系、繁殖方式等因素影响[24]。甘薯具有自交不亲和性[25],有性繁殖和无性繁殖共存。杂合率低的植物种群内及种群间基因交流程度低,基因资源稳定,环境适应能力较强[26]。郭水良等[27]认为同一科（或属）内相关物种间的DNA C-值较小的植物可能具有更强的入侵性。甘薯近缘野生种马鞍藤（Ipomoea pes-caprae L.）杂合率为0.99%,DNA C-值为1041.65 Mb[12],I. cordatotriloba杂合率为0.40%,DNA C-值为560.70 Mb;由此推测,I. cordatotriloba环境适应能力比马鞍藤更强,是进一步筛选优异基因资源、研究甘薯近缘野生种的重要材料。
从Sanger测序到第2代（Roche 454、SoLiDTM、Illumina）测序平台以及第3代PacBio测序平台,基因组测序的蓬勃发展使得测序技术普遍应用于植物研究中[28]。基因组越大、倍性越高对测序技术、机器性能要求越高;而杂合度会导致组装基因组偏大,数值高于0.5%则认为该品种不易组装,高于1%则认为该品种很难实现组装[29,30]。本研究利用二代Illumina测序平台对I. cordatotriloba进行K-mer分析,得到I. cordatotriloba基因组大小为560.70 Mb,杂合率为0.40%,重复序列比率为57.93%,GC含量为38.10%,具有一定重复率和较低的杂合度。结合染色体压片法进行染色体计数可知I. cordatotriloba为二倍体。综上所述,研究认为I. cordatotriloba为简单基因组,可尽快实施全基因组测序计划,可采用低成本二代测序技术进行全基因组测序。以上结果为I. cordatotriloba全基因组测序策略的选取和甘薯近缘野生种的利用提供参考。