全球约有40%~50%的潜在可耕种土地属于酸性土壤,主要分布在热带和亚热带地区[1]。目前,由于不恰当的耕作方式、酸雨等环境问题的影响,土壤酸度呈逐渐增加的趋势[2]。铝毒是酸性土壤上限制作物产量的主要因素。铝作为一种金属元素,广泛地分布于土壤矿物质中,通常是以对植物生长无毒的硅酸盐或氧化物形式存在[3]。当pH<5时,土壤中的铝则会形成可溶性的Al3+和作物根系结合,即使在微摩尔级别也可在数小时内抑制作物根系的生长,影响作物正常吸收水分和养分的能力,进而影响作物地上部的生长和产量的形成[4]。
橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科（Euphorbiaceae）橡胶树属（Hevea）多年生乔木,是生产天然橡胶的重要来源,主要种植于土壤酸化严重的热带地区。关于橡胶树铝毒和耐铝机制的研究报道较少,仅见张晗等[5]和安锋等[6]采用河沙和石英砂盆栽试验研究了铝胁迫对橡胶苗部分生理指标的影响,发现橡胶苗对铝的耐受浓度达到100~200 mmol/L,远高于其他作物对铝的耐受浓度,这对进一步研究橡胶树的耐铝机制奠定了基础。然而,针对橡胶树耐铝的分子机理还未见相关报道。因此,探明橡胶树耐铝的分子机理对于减轻铝对橡胶树生产和产胶的可能伤害、提高酸性土壤上天然橡胶的产量都具有重要意义。
实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）是现代分子生物学试验中常用的技术,可以对基因的表达模式进行实时监测[7]。实时荧光定量PCR技术在试验中容易受到试验样品差异、提取RNA质量、cDNA数目和质量、引物设计的合理性以及PCR反应条件等因素的影响,需要引入内参基因对目的基因的表达量数据进行标准化以减小误差[8]。常用的内参基因有Actin、18S rRNA、Ubiquitin-protein ligase（UBC）和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）等。大量研究表明,内参基因在不同植物、不同处理和组织中的表达稳定性有较大差异[9,10,11]。因此,必须根据特定的试验条件,选择稳定表达的内参基因,以此提高试验的精确性。不同植物在铝胁迫后的症状、耐受性以及相关基因的表达情况存在差异,然而针对铝胁迫下不同内参基因的表达稳定性等研究还未见报道,大多数研究选择常见的内参基因对目的基因的表达量进行校正。例如Wu等[12]在探究甘蓝BoMATE基因于不同铝浓度处理下的表达情况时选用Actin作为内参基因;Tian等[13]选择Actin、GADPH作为内参基因分析小麦根尖TaALMT1基因在铝处理后不同时间段内的表达情况。所选内参基因能否准确地反映目的基因在铝胁迫下的表达情况以及哪些基因可作为铝胁迫处理后橡胶苗根系特异性表达的内参基因尚不清楚。因此,本研究选取橡胶树的Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、UBC2（ubiquitin-protein ligase 2）、YLS8（mitosis protein YLS8）、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、UBC4（ubiquitin-protein ligase 4）、FP（F-box family protein）和ADF（actin depolymerizing factor）等10个基因作为候选内参基因,以含0、200 mmol/L AlCl3的Hoagland营养液培养2、5 d的橡胶苗根系为材料,通过实时荧光定量PCR检测,并利用内参基因分析软件geNorm[14]、NormFinder[15]、BestKeeper[16] 、Delta Ct算法[17]以及综合评价软件RefFinder[18]对10个候选内参基因的表达稳定性进行分析和评定,筛选出橡胶树在铝毒胁迫下表达最稳定的内参基因,以期为橡胶树耐铝的分子机理研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
选取橡胶树‘热研7-33-97’两蓬叶时期的组培苗作为试验材料,在Hoagland营养液（内含40 μmol/L的AlCl3,预防铝处理后可能产生的休克作用,pH调至5.5）中预培养2 d。铝胁迫处理（加入终浓度200 mmol/L的AlCl3•6H2O）和对照（不加铝）的营养液用1 mmol/L的HCl或氨水调节pH至4.2,每2 d更换一次营养液,收集铝胁迫处理2、5 d与对照的橡胶苗根系,液氮速冻后,于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 不同时间段铝处理和对照的橡胶苗根系总RNA采用天根生化科技有限公司（北京）生产的RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚植物总RNA试剂盒进行提取,使用Agilent 2100 Bioanalyzer对RNA的纯度和浓度进行测定。参考Fermentas公司的RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书对cDNA第一链进行合成,合成后于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 内参基因的筛选与引物设计 根据研究植物内参基因的相关文献和已公布橡胶树的转录组数据,选取橡胶树的Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10个基因作为候选内参基因,使用Primer 5.0软件进行引物设计,交由英潍捷基（上海）贸易有限公司进行引物合成,引物序列等信息如表1所示。
表1 候选内参基因引物序列信息Tab. 1 Primer sequence of candidate reference genes for qRT-PCR |
| 基因Gene | NCBI登录号 Accession numbers for NCBI | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 扩增长度 Amplicon length/bp |
|---|---|---|---|
| 40S rRNA | XM_021803004 | F: ACAGGCTCATCACCTCCAAG | 283 |
| R: CAACCACAAAAGTGCAATGG | |||
| 18S rRNA | AB268099 | F: GCTCGAAGACGATCAGATACC | 146 |
| R: TTCAGCCTTGCGACCATAC | |||
| YLS8 | HQ323250 | F: CCTCGTCGTCATCCGATTC | 327 |
| R: GGAGCAATAACCAAACCACGA | |||
| Actin | JF270598 | F: GATTCCGTTGCCCAGAAGTC | 144 |
| R: CACCACTCAGCACAATGTTACC | |||
| Actin7 | HQ260074 | F: GGCACTTTGGTACTCAAGTC | 102 |
| R: GAAGCATCCCAATCACTCTC | |||
| UBC2 | HQ323246 | F: CATTTATGCGGATGGAAGCA | 125 |
| R: CAGGGGAGTTTGGATTTGGA | |||
| UBC4 | HQ323249 | F: TCCTTATGAGGGCGGAGTC | 82 |
| R: CAAGAACCGCACTTGAGGAG | |||
| GAPDH | XM_021825341 | F: GACCGATTTGGCATTGTTGAGGGTC | 141 |
| R: TCCAGTGCTACTAGGAATGATGTTG | |||
| FP | HQ268026 | F: ATCAGCTTGACGCAGGTTAC | 99 |
| R: GAAACAGACGCTTCTGAGTG | |||
| ADF | HM126477 | F: GCATATCGGCACTCATCAG | 99 |
| R: GGAGAAGGCAAAGCAAGTC |
1.2.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR采用SYBR Green染料法在CFX96 Real-time PCR System（Bio-Rad, United States）上进行,反应体系为20 μL,包括SYBR Premix Ex Taq™（TaKaRa）10 μL,上游和下游引物（10 mol/L）各0.4 μL,30 ng/L的cDNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL,每个样品3个重复。qRT-PCR的反应程序分为3步,第1步95 ℃预变性3 min,95 ℃变性10 s;第2步60 ℃退火20 s;第3步72 ℃延伸30 s。总计43个循环。
1.3 数据处理
根据实时荧光定量PCR仪得到的Cq值计算2-Δq,用内参基因分析软件geNorm(https://genorm.cmgg.be/）、NormFinder（https://moma.dk/normfinder-software）、BestKeeper（http://www.Genequatification.de//bestkeeper.html#descr）和Delta Ct算法以及RefFinder软件综合分析内参基因的稳定性。
geNorm软件是基于Microsoft Excel平台创建的VBA宏程序。稳定参数M作为geNorm软件分析候选内参基因表达稳定性的衡量标准,其参考临界值为1.5,并且内参基因的M值越低,说明其表达越稳定,反之该基因的表达稳定性越低。geNorm软件还可以对候选内参基因做标准化因子的配对差异分析,组合差异值Vn/n+1的默认阈值为0.15。若Vn/n+1<0.15, 表明只需n个基因作为内参基因,无需引入第(n+1)个基因;如果Vn/n+1>0.15,则最适内参基因的数目是(n+1)个。
NormFinder软件的工作原理是通过获得组内和组间方差值来表示候选内参基因的表达稳定性,内参基因的稳定值（S）越小,表达稳定性越高,反之越低。
BestKeeper软件直接使用实时荧光定量PCR仪得到的Cq值,通过对比各个候选内参基因Cq值的标准差（standard deviation, SD）和变异系数（coefficient of variation, CV）分析候选内参基因的稳定性,SD值与CV值越小,稳定性越好。
Delta Ct算法是通过计算样品中成对基因相对表达量的平均标准偏差（average of standard deviation, STDEV）来比较候选内参基因的表达稳定性,即平均标准偏差越小,基因表达越稳定。
RefFinder软件是根据geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct 4种软件（算法）的结果赋予每个内参基因合适的权重,计算其排序值的几何平均数（geomean of ranking values）,排序值的几何平均数越小,内参基因的稳定性越高。
2 结果与分析
2.1 候选内参基因引物扩增特异性分析
提取的所有RNA样品经Agilent 2100 Bioanalyzer检测后,其A260/A280比值均在2.0左右,说明RNA无降解,质量较好。以根系cDNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测表明,10个候选内参基因的扩增条带单一,特异性好,无引物二聚体产生,可用于后续内参基因的稳定性分析（图1）。
2.2 候选内参基因的Cq值分析
Cq值是指扩增产物的荧光信号在达到设定域值时所经历的循环数。Cq值越大,表达丰度越低。如图2所示,10个候选内参基因的Cq值在铝胁迫下的变化趋势各不相同。10个候选内参基因的Cq值处于16.41~32.68之间,其中FP的Cq值最大,表达丰度最低;18S rRNA的Cq值最小,表达丰度最高,其他候选内参基因的表达丰度处于中间水平。
图2 橡胶树10个候选内参基因Cq值的箱形图箱体中的横线表示中位数,箱体上下边分别表示上/下四分位数,箱体上下两端分别表示最大/小值。 Fig. 2 Box plot of Cq values of ten candidate reference genes The horizontal line in the box represents the median, and the upper and lower sides of the box respectivelyrepresent the upper/lower quartiles, and the upper and lower ends of the box respectively indicate the maximum/minimum value. |
2.3 候选内参基因稳定性评价
2.3.1 geNorm和NormFinder软件评估结果 geNorm软件通过计算稳定参数M来评价候选内参基因的表达稳定性,M值越低,表示该内参基因的表达越稳定。由图3A可知,所选候选内参基因的M值均低于1.5。10个候选内参基因的表达稳定性由高到低的次序为UBC4=FP>40S rRNA>Actin7>Actin>ADF>UBC2>YLS8>GAPDH>18S rRNA。
橡胶树10个候选内参基因配对差异分析如图4所示,V6/7<0.15说明只需要引入6个基因,不需要引入第7个基因来消除差异,适合铝毒处理后作为内参基因组合的有UBC4、FP、40S rRNA、Actin7、Actin和ADF。
NormFinder软件表示内参基因稳定性的方式与geNorm软件类似,不同之处是没有规定参考临界值。如图3B所示,10个候选内参基因的稳定值（S）从小到大依次为40S rRNA<UBC4<Actin<FP< Actin7<ADF<UBC2<YLS8<GAPDH<18S rRNA。可见候选内参基因中表达稳定性最高的是40S rRNA,而18S rRNA的表达稳定性最低,不适合作为内参基因使用。
2.3.2 Bestkeeper软件评估结果 BestKeeper软件分析候选内参基因稳定性的方法是通过对比各个候选内参基因Cq值的标准差（SD）和变异系数（CV）,SD与CV越小,稳定性越好。使用Best- Keeper软件分析橡胶树10个候选内参基因稳定性的结果如表2所示。可以看出,Actin7的SD和CV最小,表明其稳定性最好。GAPDH的SD和CV最大,说明其稳定性最差,不适合作为内参基因使用。
表2 BestKeeper软件分析10个候选内参基因的稳定性Tab. 2 Stability analysis of ten candidate reference genes of rubber tree by BestKeeper software |
| 基因 Gene | 几何平均值 Geometric mean (Cq) | 算术平均值 Arithmetic mean (Cq) | 最小值 Min (Cq) | 最大值 Max (Cq) | 标准差 Standard deviation (±Cq) | 变异系数 CV(Cq)/% | 排名 Rank |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Actin7 | 23.75 | 23.78 | 22.12 | 25.82 | 0.96 | 4.02 | 1 |
| 18S rRNA | 18.51 | 18.56 | 16.42 | 20.84 | 1.08 | 5.80 | 2 |
| UBC4 | 26.54 | 26.57 | 24.85 | 28.24 | 1.17 | 4.39 | 3 |
| FP | 29.68 | 29.70 | 28.11 | 31.78 | 1.20 | 4.05 | 4 |
| 40S rRNA | 22.64 | 22.68 | 21.06 | 24.95 | 1.36 | 6.00 | 5 |
| Actin | 22.41 | 22.46 | 20.58 | 25.06 | 1.36 | 6.08 | 6 |
| YLS8 | 24.16 | 24.22 | 21.36 | 26.07 | 1.42 | 5.85 | 7 |
| ADF | 24.99 | 25.05 | 23.28 | 27.62 | 1.64 | 6.56 | 8 |
| UBC2 | 25.77 | 25.85 | 23.36 | 29.16 | 1.91 | 7.41 | 9 |
| GAPDH | 23.42 | 23.53 | 20.79 | 26.59 | 2.25 | 9.55 | 10 |
2.3.3 Delta Ct算法分析结果 Delta Ct算法计算结果如图5所示,平均标准偏差（STDEV）从小到大依次为40S rRNA<UBC4<Actin<FP<Actin7< ADF<UBC2<YLS8<GAPDH<18S rRNA。40S rRNA的STDEV最小,说明其表达稳定性最高。18S rRNA的STDEV最大,表达稳定性最低,不适合作为内参基因使用。
2.3.4 RefFinder软件综合评定结果 为避免单一内参基因评价软件分析结果引起的误差,使用RefFinder软件对geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct算法计算得到的结果进行综合排名。由RefFinder软件计算得到的排序值的几何平均数依次为UBC4（1.86）<40S rRNA（1.97）< FP（2.83）<Actin7（3.16）<Actin（4.05）<ADF（6.45）<18S rRNA（6.69）<UBC2（7.45）<YLS8（7.74）<GAPDH（9.24）。根据稳定值排序结果（图6）可知,UBC4的稳定性最高,40S rRNA次之。
综合3种软件geNorm、NormFinder、Best- Keeper 和Delta Ct算法以及RefFinder软件的综合评定结果可知,10个候选内参基因中UBC4、40S rRNA、FP、Actin7和Actin的表达稳定性较高,可作为内参基因分析橡胶树在铝毒胁迫下相关基因的表达情况,而GAPDH、18S rRNA、UBC2、ADF和YLS8的表达稳定性较低,尤其是GAPDH不宜作为铝胁迫下实时荧光定量PCR内参基因使用。
2.3.5 内参基因稳定性验证 为了验证筛选得到的内参基因在铝胁迫下的表达稳定性,选取表达稳定性较高的UBC4、40S rRNA和FP基因以及3个基因的组合作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸转运蛋白基因HbALMT-1（NCBI登录号:XM_021791834.1）和HbALMT-2（NCBI登录号:XM_021796406.1）在铝处理2 d（T2）和5 d（T5）以及未添加铝处理2 d（C2）和5 d（C5）时的表达水平进行了分析,同时选取了表达稳定性较差的GAPDH基因作为对照。如图7所示,以UBC4、40S rRNA和FP作为内参基因对HbALMT-1和HbALMT-2基因在铝胁迫不同天数下的表达量进行校正,发现铝胁迫后两基因的相对表达量均有所下降,并且处理5 d后的表达量低于处理2 d后的表达量。使用组合内参基因UBC4+40S rRNA+FP对2个基因的表达量数据进行校正,结果表现出与单独使用一个内参基因相同的变化趋势。而以表达稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因使用时,对目的基因的表达量均未能够进行准确量化,甚至出现了严重偏差,如HbALMT-1基因在处理5 d时的表达量高于处理2 d时的表达量,HbALMT-2基因在处理2 d时的表达量高于对照,这与使用单个内参基因以及组合内参基因对目的基因的表达进行校正时的结果严重不符。这说明橡胶树在铝胁迫下选择UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合作为内参基因是适合的,选择表达稳定性较差的内参基因则会出现较大偏差。
图7 基于不同内参基因对橡胶树HbALMT-1（A）和HbALMT-2基因（B）的表达分析图中C2,T2,C5,T5分别表示2 d和5 d的对照与处理。 Fig. 7 Expression analysis of rubber tree HbALMT-1 genes (A) and HbALMT-2 gene (B) based on different reference genes C2, T2, C5 and T5 indicated the controls and treatments at 2 d and 5 d after treatment respectively. |
3 讨论
铝毒是酸性土壤上限制作物产量的主要因素,目前针对铝毒胁迫下筛选内参基因的相关研究还未见报道。研究人员大多选择常见的内参基因,如Maron等[21]研究玉米根系在不同时间段铝处理后经转录组分析选择的19个基因的表达情况时,选择18S rRNA基因作为内参基因,而在本研究中发现18S rRNA基因的表达稳定性较差,不适合作为内参基因使用,这可能与不同物种对铝胁迫的响应存在差异有关。除已进行验证的UBC4、40S rRNA和FP基因作为内参基因使用较为合理外,4种内参基因评价软件（算法）以及综合评价软件RefFinder的结果显示,Actin和Actin7基因作为内参基因使用时的表达稳定性也较高,Grisel等[22]在研究铝胁迫下白杨根中相关基因转录水平的表达情况时也选择了Actin作为内参基因。GAPDH基因被广泛地用作内参基因使用,如Tian等[13]在研究铝处理后不同时间段内小麦根尖TaALMT1基因的表达情况时选择GADPH作为内参基因;朱友银等[23]研究表明GAPDH基因可作为内参基因在研究中国樱桃低温和盐碱胁迫下的相关基因表达时使用。但本研究中GAPDH基因的表达稳定性较差,利用其作为内参基因使用时,可能会对目的基因的表达情况产生误判;GAPDH在盐胁迫下玉兰各组织中的表达也不稳定[24]。由此可见,选择合适的内参基因是保证实时荧光定量PCR试验结果准确性的重要前提条件,合适的内参基因要根据不同的研究目的、植物类型以及试验条件等进行评价,方能保证实时荧光定量PCR试验结果的可靠性。
目前常用的内参基因评价软件（算法）有geNorm、NormFinder、BestKeeper以及Delta Ct,由于各个软件（算法）的计算原理不尽相同,导致内参基因的稳定性排序略有差异,尤其是BestKeeper软件所得结果与其他3种软件（算法）计算结果差别较大,如18S rRNA经过BestKeeper软件计算后排名第二,而在其他3个软件（算法）计算结果中排名比较靠后,表达稳定性较差,这表明仅利用一种软件对候选内参基因的稳定性做出评价并不完全合理。因此,本研究利用综合评价软件RefFinder根据4种软件（算法）的结果进一步计算了10种候选内参基因排序值的几何平均值,发现UBC4、40S rRNA、FP、Actin7和Actin是排名前五的内参基因,表明这5种基因的表达稳定性较高,可作为内参基因使用。ALMT（aluminum-induced malate transporter）基因的功能已在小麦[25]、玉米[26]、油菜[27]等多种植物中研究表明会响应铝胁迫,故本研究根据已经筛选得到的UBC4、40S rRNA和FP基因以及geNorm软件得到的配对差异分析结果,使用3个组合基因作为内参基因对HbALMT-1和HbALMT-2基因在铝胁迫不同天数下的表达量进行了校正,进一步证明了其作为内参基因使用的可靠性。
铝毒胁迫下包括橡胶树在内的很多植物内参基因的筛选还未见报道,因此从提高橡胶树在铝毒胁迫下相关基因的表达分析结果的准确性出发,本研究选取了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10个内参基因,分析这些内参基因在铝胁迫下不同时间段的表达稳定性。结果表明,UBC4、40S rRNA、FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合作为内参基因对于分析橡胶树在铝毒胁迫下相关基因的表达情况是比较合适的。但因为铝毒对植物的伤害主要表现在根部,研究仅比较了铝胁迫处理下橡胶苗根系中表达最稳定的内参基因,并未涉及其他器官。