牛樟（Cinnamomum kanehirae Hay）隶属于樟科樟属,又名黑樟,为中国台湾地区特有常绿阔叶树种[1]。牛樟具有很高的经济价值,根、茎、叶全株可提炼牛樟精油,木材是雕刻家具的上等材料。此外,牛樟是牛樟芝（Antrodia camphorata）的唯一宿主,牛樟芝在医学上被称为“药芝之王”,常用来醒酒与缓解疲劳,具有免疫调节、保护肝脏等作用[2]。有关牛樟的研究起步晚,研究方向单一且以宏观研究为主,主要集中在牛樟的组培快繁[3,4]、扦插[5]、引种[6]等方面。近年来,在牛樟分子生物学遗传多态性上的研究取得了一些进展[7,8],但有关牛樟细胞遗传学上的研究至今仍旧空白。
染色体核型分析主要通过研究其染色体数目及形态特征,反映不同物种或品种之间存在的染色体细胞学差异[9]。不同物种的染色体核型模式在进化的过程中不受外界环境因素干扰和影响,在一定程度上反映出其进化的基本特征[10]。因此,植物核型的研究不仅能为种间遗传变异、系统演化以及亲缘关系提供证据,还可以为杂交育种选育及杂种后代鉴定等提供理论依据[11]。樟科植物核型的研究已取得一些进展,已报道过核型研究的樟科植物共有42种,涉及樟属、楠属、润楠属、新木姜子属、无根藤属和檫木属等多属品种。Okada等[12]于1975年报道了樟科9属16种植物的染色体数目,基数均为12。陈成彬等[13]于1998年报道了樟科5属9种植物的染色体数目,均为2n=24。陈细芳等[14]于2009年报道了浙江楠的染色体数目为2n=24。刘玉香[15]于2013年报道了樟科5属17种植物的染色体数目为24。在这42种植物中,核型类型为“1A”“1B”“2A”“2B”4种类型,尚未发现C类型的核型。其中,樟属中有10种植物的核型已报道,包括大叶樟、沉水樟、阴香、樟树、油樟等,染色体均为24条,核型类型为2B、2A两种类型。至今,有关牛樟的染色体核型分析的研究仍未见报道。因此,本研究以尖叶牛樟根尖为材料,对其染色体制片技术进行优化并对其进行核型分析,为牛樟的演化、进化特征和遗传规律的研究提供重要的细胞遗传学佐证。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为尖叶牛樟组培苗的根尖,采自广东省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心良种组培实验室。
1.2 方法
1.2.1 取材和预处理 于9:00—11:00采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖（0.5~1 cm）,分别采用以下方法（表1）进行预处理。再清水冲洗预处理液3~4次,把根尖移至卡诺固定液（无水乙醇:冰乙酸的比例为3:1）固定24 h,最后置于70%乙醇中4 ℃保存备用。
表1 根尖预处理方法Tab. 1 Tests of different pretreatments on root tip |
| 处理 Treatment | 预处理试剂 Pretreatment reagent | 预处理温度 Pretreatment temperature/℃ | 预处理时间 Pretreatment time/h |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.002 mol/L 8-羟基喹啉 | 黑暗25 | 2 |
| 2 | 饱和对二甲苯 | 黑暗25 | 2 |
| 3 | 冰水混合物 | 4 | 24 |
1.2.2 染色体标本制备 染色体标本制备采用酶解去壁低渗法,具体步骤参照官锦燕[16]硕士论文。
（1）前低渗:把固定好根尖置于蒸馏水中进行前低渗30 min。
（2）酶解:把步骤（1）的根尖置于盛有5%纤维素酶和4%果胶酶混合液的1 mL离心管中,并置于37 ℃的恒温水浴锅中酶解3~5 h。
（3）后低渗:吸取酶液,缓缓地沿着管壁加入蒸馏水,后低渗30 min。
（4）后固定:吸取蒸馏水,滴加临时配制的固定液,后固定15 min。
（5）涂片:把玻片、临时配制的固定液均置于冰面上,取1张玻片,先滴3滴固定液,再夹取根尖置于玻片上,用解剖针挑取白色的根尖分生组织,并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上,再从载玻片一端滴加1滴固定液使细胞扩散,接着在火焰上迅速烘烤,自然风干。
（6）染色:将KH2PO4和Na2HPO4混合缓冲液（pH 6.8）与吉姆萨原液按比例为49:1配制成工作液,再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10~20 min,清水冲洗干净,置烘箱37 ℃烘干。
臂比（r）=长臂(S)/短臂(L)
染色体相对长度=染色体长度/染色体组总度×100%
平均长度核型不对称系数（As.k）=长臂总长/全组染色体总长×100%
2 结果与分析
2.1 牛樟染色体制片技术的优化
表2 不同预处理方法对牛樟染色体制片的影响Tab. 2 Effect of different pretreatment methods on chromosome of C. kanehirae Hay |
| 处理 Treatment | 中期细胞所占比例 Proportion of metaphase cell/% | 染色体分散效果及清晰度 Dispersion and distinguish degree of chromosome |
|---|---|---|
| 1 | 14.37 | 分散性良好、聚缩、形态清晰、可见溢痕 |
| 2 | 9.29 | 分散性良好、聚缩、有拖尾现象 |
| 3 | 3.89 | 分散性一般、聚缩不够、形态模糊 |
2.2 牛樟染色体核型分析
2.2.1 染色体数目 尖叶牛樟的染色体数目为2n=24,为二倍体。
表3 尖叶牛樟染色体核型参数Tab. 3 Parameters of chromosome karyotype of C. kanehirae Hay |
| 染色体序号 Serial number for chromosome | 染色体相对长度Relative length/% | 臂比值（长/短） Arm ratio (L/S) | 染色体类型 Type | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 长臂Long arm | 短臂Short arm | 总长Total length | |||
| 1 | 6.62 | 5.60 | 12.22 | 1.18 | m |
| 2 | 6.24 | 4.49 | 10.73 | 1.39 | m |
| 3 | 5.86 | 4.84 | 10.70 | 1.21 | m |
| 4 | 4.49 | 4.08 | 8.57 | 1.10 | m |
| 5 | 4.49 | 3.69 | 8.18 | 1.22 | m |
| 6 | 4.49 | 3.43 | 7.92 | 1.31 | m |
| 7 | 4.33 | 3.06 | 7.39 | 1.42 | m |
| 8 | 4.98 | 2.16 | 7.14 | 2.30 | sm |
| 9 | 4.08 | 3.06 | 7.14 | 1.33 | m |
| 10 | 3.82 | 2.80 | 6.62 | 1.36 | m |
| 11 | 3.06 | 2.55 | 5.61 | 1.20 | m |
| 12 | 2.90 | 2.55 | 5.35 | 1.10 | m |
3 讨论
3.1 尖叶牛樟染色体制片的优化
染色体制片技术是核型分析、基因定位等细胞学研究的基础。不同的物种在取材、预处理、解离和制片方法上有较大的差异,预处理和解离的效果直接关系到制片的质量。刘玉香[15]对17种樟科植物进行核型分析研究,表明以根尖为材料,用0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液预处理2 h,采用压片法在60 ℃的1 mol/L HCl解离3 min能达到理想的处理效果。陈细芳等[14]对浙江楠进行核型分析研究采用对二氯苯饱和预液处理根尖3~5 h,用压片法在60 ℃的1 mol/L HCl解离12~ 15 min也取得较好的效果。陈成彬等[13]采用酶解去壁低渗法对樟科5属9种植物进行核型分析。本研究首次报道牛樟染色体制片技术和核型,研究表明采用8-羟基喹啉在黑暗条件下对根尖预处理2 h,采用酶解去壁低渗法制片并以5%纤维素酶和4%果胶酶混合液酶解5 h,所得制片效果最佳,预处理方式和刘玉香[15]所采用的相同。采用压片法和酶解去壁低渗法均能获得良好效果。
3.2 牛樟染色体数目及核型特征的探讨
Stebbins[18]对大量核型资料进行分析,认为核型由对称向不对称发展是植物界核型进化的基本趋势;核型不对称系数越接近50%,核型的对称程度越高,进化程度越低,属于越原始的植物。对已报道的42种樟科植物,发现核型有“1A”“1B”“2A”“2B”4种类型,没有发现“C”类型的核型,说明樟科植物的核型总体上较为对称,在系统进化中可能属于较为原始的类型。其中,樟属中大叶樟、沉水樟等4种属于2B类型,核不对称系数在56.44%~60.78%之间。本研究得出尖叶牛樟核型不对称系数为55.81%,接近50%,且属于2B类型,由此推断尖叶牛樟可能属于比较原始的物种,进化程度较低。