我国甘薯（Ipomoea batatas L.）的种植面积和总产量均居世界首位[1]。在我国,每年除用于当季销售外,绝大多数甘薯被短期或长期贮藏,以满足甘薯的周年供应。甘薯含水量高、皮薄肉嫩,在机械化采收过程中易受机械损伤。据统计,每年约有15%的甘薯因贮藏不当而霉烂[2,3],其中因机械损伤导致病菌侵染而引起的腐烂占总损失的50%以上。
甘薯遭受机械损伤后,体内自我防御系统受伤信号的转导快速做出响应,启动自我修复功能,可在损伤部位形成愈伤组织[4,5]。但自然愈伤时间较长、伤口薄壁细胞分化速率缓慢,且实际生产多在伤口未完全愈合的情况下即将甘薯入贮,导致贮藏期间甘薯腐烂。研究表明,通过物理和外源物质的添加能够诱导伤口周围细胞壁的氧化修饰,加速次生代谢产物的积累过程,快速形成愈伤组织[6]。因此,研究甘薯机械损伤后的快速愈合极为重要。
脱落酸（abscisicβacid,ABA）又名休眠素,是一种重要的半萜类植物激素,在植物抗逆性中起重要的调控作用[7]。ABA是植物中普遍存在的天然物质,毒性弱（LD50≥5000 mg/kg）[7]、安全性高,现已作为重要的植物抗性激素广泛用于果蔬采前和采后方面的研究。研究表明,马铃薯损伤后可诱导ABA代谢相关基因表达[8],促进马铃薯伤口形成愈伤组织[9]。ABA还参与番茄果实茎疤组织根部的伤口愈合过程[10]。此外,ABA在猕猴桃[11]、草莓[12]、荔枝[13]等果蔬的愈伤中均表现出较好的效果。ABA诱导果蔬伤口愈合的难易程度主要与激活苯丙烷代谢、增强防御酶体系以及合成次生代谢产物有关[14]。目前,有关采后ABA处理对甘薯块根愈伤的相关研究鲜见报道。本研究结合近年来我国甘薯产业发展中存在的采后甘薯伤口自然愈合速率慢和贮藏损失率高的问题,拟采用ABA处理对甘薯进行愈伤诱导,探究ABA处理对甘薯块根的愈伤作用,以期为甘薯伤口的快速愈合提供理论和方法依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 供试‘北京1号’甘薯购于四川省雅安市雨城区农贸市场,挑选外观规整、大小均匀[(250±30)g]、无损伤且无病虫害的新鲜甘薯,清洗晾干待处理。实验所用ABA（分析纯）由北京格林博远生物科技有限公司提供。
1.1.2 仪器与设备 UV-1800PC型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;HH-2A电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）;HHWS-Ⅱ-200恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）;TGL-16gR高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 样品处理 将清洗后的甘薯用1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒3 min,蒸馏水冲洗晾干待用。擦皮刀用95%乙醇擦拭消毒后,利用擦皮刀对甘薯表皮进行仿机械损伤处理,损伤的长、宽、深为40 mm×10 mm×3 mm,每个甘薯2处伤口。将损伤甘薯分别用25、50、100、200 mg/L的ABA和蒸馏水（对照,CK）进行喷雾处理后,置于(25±5) ℃,相对湿度为(80±5)%黑暗环境下愈伤5 d,以木质素生成量、愈伤时间为依据,评价采后ABA处理对甘薯机械损伤的愈伤效果。每个处理用甘薯200个,重复3次。
1.2.2 取样 愈伤第0、1、2、3、4天分别用不锈钢刀切取人工损伤部位组织和皮下2 mm厚的愈伤组织,锡箔纸包裹置于-80 ℃的超低温冰箱内冻藏后用于各项指标测定。测前需将样品切碎、混匀后进行研磨匀浆处理。
（2）苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定。参照张静荣等[16]的方法,单位以每分钟290 nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位（U）,记为U/g。
$\text{U/g}=\frac{\Delta {{A}_{290}}\times {{V}_{\tau }}}{0.01\times {{V}_{s}}\times t\times \text{FW}}$
（3）过氧化物酶（POD）活性测定。参照张静荣等[16]的方法,略有修改,单位以每分钟470 nm处吸光值变化0.001作为1个酶活力单位（U）,记为U/g。
$\text{U/g}=\frac{\Delta {{A}_{470}}\times {{V}_{t}}}{0.001\times {{V}_{s}}\times t\times \text{FW}}$
（4）多酚氧化酶（PPO）活性测定。参照Li等[17]的方法,单位以每分钟525 nm处吸光值变化0.01作为1个酶活单位（U）,记为U/g。
$\text{U/g}=\frac{\Delta {{A}_{525}}\times {{V}_{t}}}{0.01\times {{V}_{s}}\times t\times \text{FW}}$
以上3式中,ΔA290、ΔA470、ΔA525为反应时间内吸光值的变化;Vt为酶提取液总体积（mL）;Vs为测定时所取酶液的体积（mL）;t为反应时间（min）;FW为样品鲜重（g）。
（6）失重率的测定。采用称量法测定[18]。
$失重率=\frac{M-m}{M}\times 100\%$
式中,M为处理前甘薯的初始重量（g）;m为测定时甘薯的重量（g）。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010软件计算平均值、标准偏差,并通过单因素方差分析法对数据进行F检验。
2 结果与分析
2.1 不同浓度ABA处理对甘薯块根愈伤期间木质素含量的影响
2.2 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间PAL酶活性的影响
适宜的ABA浓度是促进伤口快速愈合的关键,浓度过高会导致氧化聚积形成的木质素多聚物的PAL和漆酶受膜转运蛋白影响发生突变,阻碍伤口愈合。PAL是促进果蔬伤口组织次生代谢的关键酶和限速酶。由图2可以看出,100 mg/L ABA与CK的PAL酶活性总体呈先升后降的趋势,愈伤0~3 d时,100 mg/L ABA处理甘薯PAL酶活性始终高于CK,第3天时急剧升高达到了峰值417 U/g,较CK提高了57%,说明100 mg/L ABA处理对甘薯愈伤期间PAL酶活性的提高起到了积极作用。
2.3 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间POD酶活性的影响
2.4 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间PPO酶活性的影响
2.5 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间总酚含量的影响
2.6 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间类黄酮含量的影响
2.7 采后ABA处理对甘薯块根愈伤期间失重率的影响
2.8 ABA处理后甘薯木质素含量、愈伤防御酶活力及其代谢产物之间的相关性
由表1可知,ABA处理甘薯木质素含量与总酚、类黄酮含量之间呈极显著相关（P<0.01）,相关系数分别为0.987和0.984,说明总酚、类黄酮的生成和积累对甘薯块根木栓化组织的形成具有积极作用。ABA处理甘薯PAL酶活力与POD和PPO酶活力之间呈极显著相关（P<0.01）,相关系数分别是0.962和0.965。由此表明,POD和PPO酶活力在催化苯丙烷代谢途径的发生发展及愈伤防御体系的形成方面发挥了重要作用。
表1 ABA处理后甘薯木质素含量、愈伤防御酶活力及其代谢产物之间的相关性Tab. 1 Correlation between lignin content, callus defense enzyme activity and metabolites of sweet potato after ABA treatment |
| 指标 Index | 木质素含量 Lignin content | PAL酶活力 PAL enzyme activity | POD酶活力 POD enzyme activity | PPO酶活力 PPO enzyme activity | 总酚含量 Total phenolic content | 类黄酮含量 Flavonoid content |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 木质素含量 | 1.000 | 0.737 | 0.843 | 0.853 | 0.987** | 0.984** |
| PAL酶活力 | 1.000 | 0.962** | 0.965** | 0.744 | 0.689 | |
| POD酶活力 | 1.000 | 0.984** | 0.816 | 0.813 | ||
| PPO酶活力 | 1.000 | 0.848 | 0.839 | |||
| 总酚含量 | 1.000 | 0.968** | ||||
| 类黄酮含量 | 1.000 |
Note: ** indicated extremely significant at 0.01 level. | |
注: **表示具有极显著相关性（P<0.01）。 |
3 讨论
作为植物生长发育过程中重要的“胁迫激素”,ABA可调控多种果蔬的采后抗逆性[7]。本研究发现,采后ABA处理可通过激发甘薯损伤部位组织的苯丙烷代谢、提高愈伤防御酶活性及次生代谢产物的合成,促进甘薯块根愈伤组织的形成。
愈伤组织的形成是次生代谢产物和抗性物质积累的过程,木质素作为果蔬愈伤过程中重要的次生代谢产物,当果蔬受到损伤胁迫时,会通过合成和积累形成木栓化组织,起到保护和隔离的作用[25,26]。本研究发现,不同浓度ABA处理均可有效促进甘薯伤口处愈伤木栓组织形成,其中100 mg/L ABA处理的甘薯木质素含量最高,愈伤效果最好,此结果与李雪等[27]对马铃薯的研究结果一致。苯丙烷代谢途径在采后果蔬愈伤过程中具有重要作用[28],PAL作为果蔬苯丙烷代谢途径的关键酶,催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸,进一步合成次生代谢产物增强果蔬抗性。伤口组织中PAL酶活性升高可加速果蔬的木栓化过程[29],愈伤0~3 d时,100 mg/L ABA处理可有效促进甘薯PAL酶活性的上升,之后有所下降,可能是果蔬受损伤胁迫时,苯丙烷代谢被激活,PAL催化产生较多木质素、类黄酮、总酚等次生代谢产物,当这些产物累积到一定程度后又会通过反馈抑制PAL酶活性,以减少营养物质消耗[30]。与此类似的结果在番茄[31]中也有报道。酚类物质作为木质素的前体物质,具有较强的抗氧化能力,可有效清除自由基,延缓果实的衰老,在果蔬愈伤中具有促进伤口修复的作用[32]。作为植物的抗菌组分,类黄酮在提高果蔬对病原菌侵染的抗性方面起到了重要作用[33]。本研究发现,采后ABA处理可有效促进甘薯块根总酚和类黄酮含量的生成和积累,该结果与李雪等[27]在马铃薯块茎愈伤中的研究结果一致。
POD是木栓化组织形成过程中的关键酶,参与催化肉桂酸的聚合,促进愈伤组织的形成[34]。陶晓亚[35]通过研究ABA对‘新太阳’番茄愈伤和木栓质合成的影响规律发现ABA处理可提高POD酶活性,促进番茄伤口愈合,这与本研究的结果一致（图3）。PPO是果蔬愈伤组织中重要的氧化酶类,能催化果蔬原料中的内源性多酚物质氧化生成醌类化合物,醌对病原菌具有很高的毒性,可有效抑制病原菌的生长[16]。采后ABA处理能在一定程度上促进‘北京1号’甘薯愈伤期间PPO酶活性的升高,这与前人用ABA处理番茄的研究结果类似[36]。失重现象主要由水分蒸腾和呼吸消耗引起,是影响果实外观和品质的重要因素之一,也是评价愈伤效果的重要指标。本研究发现,采后ABA处理可有效减少甘薯重量损失,该结果与陶晓亚等[30]采用ABA对番茄的损伤愈合研究结果一致。
综上所述,采后ABA处理能有效促进‘北京1号’甘薯愈伤木栓组织形成,其中以100 mg/L ABA愈伤3 d效果最佳。经100 mg/L ABA处理后,甘薯机械损伤部位的PAL、POD和PPO酶活性明显提高,总酚、类黄酮含量显著增加,表明采后ABA处理可有效激活苯丙烷代谢、提高愈伤防御酶活性,促进甘薯块根愈伤组织的形成。