可可为热带地区重要的经济作物,因其独特的风味和营养价值,被广泛应用于巧克力、固体饮料、休闲食品、医药品、化妆品等领域[1]。近年来,国内外对可可的相关研究主要集中在可可豆中的多酚类物质。研究结果表明,可可豆是一种富含多酚类物质的食品来源,其具有极强的抗氧化活性,能有效地清除羟自由基（OH）和超氧阴离子自由基（O2-）,有效地抑制脂质氧化[2]。
可可豆中富含多酚类物质,其可以进一步分类为类黄酮,并且这些类黄酮中含有丰富的原花青素[3]。在可可豆中最常见的类黄酮是黄烷-3-醇、儿茶素、表儿茶素和原花青素,其中原花青素含量较高。黄酮类化合物是可可豆中重要的组成成分,其能够提供潜在的心血管健康益处,有助于平衡体内胆固醇,具有抗氧化作用[4]。虽然已知可可豆中含有多酚类化合物,但总含量因原产国、加工方式等不同而异。原花青素或缩合单宁主要由儿茶素的二聚物,低聚物和聚合物组合而成[5],这些原花青素使可可豆的风味呈现苦味[6]。谷风林等[7]研究了海南可可豆的多酚含量,对不同发酵方式下的可可多酚类化合物进行了定量分析;Nazaruddin等[8]研究发现,在可可豆发酵过程中,由于进一步的氧化作用,多酚化合物缩合,豆中的原花青素浓度降低;Gultekin等[9]研究表明,焙烤中温度的升高显著降低了包括原花青素的多酚水平。目前,关于可可发酵豆的原花青素优化提取工艺的研究未见报道。
响应面分析法（response surface methodology, RSM）是合理利用试验设计,采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过分析回归方程从而寻求最佳工艺参数,解决多变量问题的一种统计学方法。能够以较少的试验数量和时间对实验进行全面研究,同时可评价各因素间的交互作用[10,11]。
为研究不同提取条件对可可豆中的原花青素提取得率的影响,本研究以海南可可豆作为研究对象,采用响应面分析法,以提取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度作为影响因素,以海南可可豆中的原花青素提取得率为考察指标,对可可豆中原花青素的提取工艺进行优化,为海南可可豆的开发利用提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 可可鲜果（品种为‘热引4号’）采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所内,采摘时生长期为5个月,果皮为黄色、淡红色的成熟鲜果。原花青素标准品（纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司）,香草醛（上海国药控股有限公司）,甲醇（美国Fisher公司）,乙醇、盐酸均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 FD-2A冷冻干燥机,北京博医康;Master-S plus UVF实验室专用超纯水机,中国和泰;AL104电子天平,美国Mettler-Toledo;SHZ-C水浴恒温振荡器,上海博迅;Specord 250 Plus紫外可见分光光度计,德国耶拿;DLSB- 5L/10低温冷却液循环泵,巩义予华;MB45快速水分测定仪,美国奥豪斯;R-215旋转蒸发仪,瑞士步琪。
1.2 方法
1.2.1 实验材料的制备 收获新鲜成熟可可果,将其中的可可鲜豆取出并放入木箱中发酵,箱底部留有排液孔,发酵时可可鲜豆外层果肉中的胶体粘液物质化成发酵液伴随发酵进程排出,周围保持通风,发酵时木箱上部用亚麻布覆盖[12]。发酵木箱（0.8 m×0.8 m×0.8 m）由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供,可可果为同一季节收获并成熟。发酵时间为7 d,期间定时用木铲搅拌可可豆,并进行倒箱,发酵完成后的豆子经清洗、日晒干燥、真空冷冻干燥、去皮、精磨、脱脂待用。
1.2.2 原花青素标准曲线的绘制 采用香草醛-盐酸法,在Ma等[13]的研究方法基础上,略作修改。准确称取原花青素标准品20 mg放于50 mL容量瓶并用色谱甲醇充分溶解定容。准确吸取原花青素标准溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,放于10 mL容量瓶中并用甲醇定容。分别取1 mL于10 mL具塞试管中,依次加入3 mL香草醛甲醇溶液（4%）和1.5 mL浓盐酸,用甲醇稀释至刻度并混合均匀,室温条件下,避光反应20 min;将去离子水替代样品反应体系作为参比,于500 nm处测定吸光度。拟合不同浓度的吸光度值,得到标准曲线,以吸光度值对质量浓度进行回归分析,得到标准曲线方程为y=8.8703x+ 0.0345,R2=0.9927。
1.2.3 可可豆中原花青素的测定 参照Ma等[13]研究的提取方法并略作修改,准确称取脱脂的可可粉置于50 mL具塞锥形瓶中,加入提取溶剂乙醇后放入水浴恒温振荡器中加热提取,提取液通过0.45 µm微孔滤膜真空抽滤,除去固形物,得到待测溶液。准确量取1 mL待测溶液,用提取溶剂稀释10倍,参照标准溶液的测定方法,在波长500 nm处,测定样品溶液的吸光度值,代入标准曲线方程,计算得到各样品的原花青素含量。
原花青素含量= [C×V ×n/W]×100%
式中：C为原花青素浓度（mg/mL）;V为提取液的体积（mL）;n为稀释倍数;W为样品的质量（mg）。
1.2.4 单因素试验 以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为因素条件进行单因素试验,分别考察各因素对可可中原花青素提取得率的影响（表1）。
表1 单因素试验因素及水平Tab. 1 Factors and levels for single factor experiments |
| 因素Factor | 水平Level | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| A 乙醇浓度/% | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 |
| B 料液比/(g·mL-1) | 1∶5 | 1∶10 | 1∶15 | 1∶20 | 1∶25 |
| C 提取时间/h | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 |
| D 提取温度/℃ | 45 | 55 | 65 | 75 | 85 |
1.2.5 响应面试验 根据Box-Behnken设计原理,在单因素试验的基础上,运用Design-Expert 8.0.6软件,以可可原花青素提取得率为响应值,设置乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）的4因素3水平的试验条件。试验的因子及水平如表2。
表2 试验设计因素水平表Tab. 2 Factors and levels of RSM |
| 水平 Level | 因素Factor | |||
|---|---|---|---|---|
| A乙醇浓度 Ethanol concentration/% | B料液比 Material-to- liquid ratio /(g·mL-1) | C时间 Extraction time/h | D温度 Extraction temperature/℃ | |
| -1 | 60 | 1∶15 | 1 | 65 |
| 0 | 70 | 1∶20 | 1.5 | 75 |
| 1 | 80 | 1∶25 | 2 | 85 |
1.3 数据处理
采用Origin Pro 9.1软件进行误差分析并绘制图形,用以评估不同提取条件对可可豆中原花青素提取得率的影响,使用Design-Expert 8.0.5设计软件进行响应面分析,优化海南可可豆中原花青素的提取工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验分析
2.1.1 乙醇浓度对可可豆中原花青素提取得率的影响 当料液比1∶20,提取温度为75 ℃,提取时间为1.5 h时,采用50%、60%、70%、80%、90%体积分数的乙醇溶液提取可可原花青素,以乙醇浓度为横坐标,原花青素提取得率为纵坐标作图,见图1。
2.1.2 料液比对可可豆中原花青素提取得率的影响 当乙醇浓度为70%,提取温度为75 ℃,提取时间为1.5 h时,设置料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）,以料液比为横坐标,原花青素提取得率为纵坐标作图,如图2。
2.1.3 提取时间对可可豆中原花青素提取得率的影响 在乙醇浓度为70%,料液比为1∶20（g/mL）,提取温度为75 ℃条件下,设置提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h,设定提取时间为横坐标,原花青素提取得率为纵坐标作图,如图3。
2.1.4 提取温度对可可豆中原花青素提取得率的影响 当乙醇浓度为70%,料液比为1∶20（g/mL）,提取时间为1.5 h时,设置提取温度分别为45、55、65、75、85 ℃,设定提取温度为横坐标,原花青素提取得率为纵坐标作图,如图4。
根据单因素试验的结果分析显示,乙醇浓度70%、料液比1∶20（g/mL）、提取温度75 ℃、提取时间90 min为各单因素的最大响应值。
2.2 响应面优化原花青素提取试验分析
Y=6.04-0.98A-0.092B-0.15C+0.3D-0.41AB-0.062AC+0.015AD-0.17BC+0.022BD+0.12CD-1.57A2-0.45B2-1.24C2-1.95D2
表3 响应面试验结果Tab. 3 Results of response surface methodology |
| 序号 Order | A | B | C | D | 原花青素提取得率 Extraction rate of procyanidin/% | 序号 Order | A | B | C | D | 原花青素提取得率 Extraction rate of procyanidin/% | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实际值 | 预测值 | 实际值 | 预测值 | ||||||||||
| 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 3.83 | 3.86 | 16 | 1 | 0 | 0 | -1 | 1.62 | 1.21 |
| 2 | -1 | 1 | 0 | 0 | 5.85 | 5.32 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.18 | 6.04 |
| 3 | 0 | 1 | -1 | 0 | 4.69 | 4.58 | 18 | 1 | 0 | 1 | 0 | 2.00 | 2.02 |
| 4 | -1 | 0 | 0 | -1 | 3.12 | 3.21 | 19 | 0 | 0 | -1 | 1 | 3.26 | 3.17 |
| 5 | -1 | 0 | 1 | 0 | 4.15 | 4.11 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.01 | 6.04 |
| 6 | 0 | 1 | 0 | -1 | 2.73 | 3.22 | 21 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.94 | 6.04 |
| 7 | 0 | -1 | 0 | 1 | 4.37 | 4.00 | 22 | 1 | -1 | 0 | 0 | 3.31 | 3.53 |
| 8 | 0 | 0 | 1 | -1 | 2.50 | 2.27 | 23 | 0 | -1 | -1 | 0 | 4.44 | 4.42 |
| 9 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3.38 | 3.10 | 24 | -1 | 0 | 0 | 1 | 3.17 | 3.77 |
| 10 | 0 | -1 | 0 | -1 | 3.36 | 3.45 | 25 | 1 | 1 | 0 | 0 | 2.61 | 2.52 |
| 11 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1.73 | 1.83 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.81 | 6.04 |
| 12 | 0 | -1 | 1 | 0 | 4.15 | 4.46 | 27 | -1 | -1 | 0 | 0 | 4.90 | 4.68 |
| 13 | 0 | 1 | 1 | 0 | 3.71 | 3.93 | 28 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.24 | 6.04 |
| 14 | -1 | 0 | -1 | 0 | 4.20 | 4.30 | 29 | 0 | 0 | -1 | -1 | 2.85 | 2.82 |
| 15 | 1 | 0 | -1 | 0 | 2.30 | 2.45 | |||||||
式中：Y为可可原花青素的提取得率,A为溶剂浓度,B为料液比,C为提取时间,D为提取温度。该方程的相关系数R2 = 0.9669,R2adj= 0.9338,说明方程的拟合度较高。由此得知,此模型可用于分析和预测可可中原花青素的提取工艺条件。在方程中,各项系数的大小和正负表示自变量（因素水平）对因变量（提取得率）的影响程度。根据回归方程可得知,A（乙醇浓度）的二次项和D（提取温度）的二次项对原花青素提取得率的影响最大,A（乙醇浓度）和B（料液比）的交互项、A（乙醇浓度）对原花青素提取得率的影响较大。通过比较方程中一次项系数绝对值大小,可直接判断影响因子的主次[11],由回归方程可知,溶剂浓度对可可中原花青素提取得率的影响较大,其次为提取温度、提取时间和料液比。2.2.2 回归模型分析 通过方差分析（ANOVA）测试每个响应值的回归模型,得到的分析结果见表4。由表4可知,模型的P<0.0001,表明模型显著。其中一次项A、二次项A2、B2、C2、D2对响应值影响极显著（P<0.01）;一次项D、交互项AB对响应值影响显著（P<0.05）;其余项均为不显著（P>0.05）。失拟项P=0.0598>0.05,显示模型失拟度不显著,其他因素对试验结果干扰较小,回归模型能代替实验真实点解释响应结果,能较好的反应数据。
表4 回归模型的方差结果Tab. 4 Results of variance for regression model |
| 来源 Source | 平方和 Sum of squares | 自由度 df | 均方 Mean square | F值 F value | P值 P value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 51.97 | 14 | 3.71 | 29.22 | <0.0001 | ** |
| A | 11.64 | 1 | 11.64 | 91.64 | <0.0001 | ** |
| B | 0.10 | 1 | 0.10 | 0.81 | 0.3839 | |
| C | 0.29 | 1 | 0.29 | 2.24 | 0.1563 | |
| D | 1.06 | 1 | 1.06 | 8.31 | 0.0120 | * |
| AB | 0.68 | 1 | 0.68 | 5.36 | 0.0363 | * |
| AC | 0.016 | 1 | 0.016 | 0.12 | 0.7310 | |
| AD | 0.0009 | 1 | 0.0009 | 0.0071 | 0.9341 | |
| BC | 0.12 | 1 | 0.12 | 0.94 | 0.3495 | |
| BD | 0.00203 | 1 | 0.00203 | 0.016 | 0.9013 | |
| CD | 0.055 | 1 | 0.055 | 0.43 | 0.5204 | |
| A2 | 16.08 | 1 | 16.08 | 126.52 | <0.0001 | ** |
| B2 | 1.32 | 1 | 1.32 | 10.36 | 0.0062 | ** |
| C2 | 9.98 | 1 | 9.98 | 78.56 | <0.0001 | ** |
| D2 | 24.77 | 1 | 24.77 | 194.98 | <0.0001 | ** |
| 残差 | 1.78 | 14 | 0.13 | |||
| 失拟项 | 1.66 | 10 | 0.17 | 5.37 | 0.0598 | |
| 纯误差 | 0.12 | 4 | 0.031 | |||
| 总离差 | 53.75 | 28 |
Note: ** indicates that the impact is extremely significant (P<0.01); * indicates that the impact is significant (P<0.05). | |
注：**表示影响极显著（P<0.01）;*表示影响显著（P<0.05）。 |
考虑到实际操作的可行性,将其中因素给予适当调整。最佳工艺参数为：溶剂浓度67%、料液比1∶20（g/mL）、提取温度76 ℃、提取时间88 min,此条件下进行3次平行试验验证,得到可可豆中原花青素平均提取得率为6.21%,结果与理论值相差不大,表明试验模型可靠。
3 讨论
原花青素是可可中主要的多酚类物质,同时还广泛存在于很多植物果实、种子、花和果皮中[22]。樊梓鸾等[14]对悬钩子的研究显示,提取溶剂浓度变化影响多酚物质的溶出效果,原花青素含较多羟基且具有极性,当溶剂极性和原花青素极性相当时,溶解度值最大,溶剂浓度不断增加时,原花青素得率降低。这可能是部分醇溶性成分溶出,同原花青素竞争与乙醇的结合。陈健等[10]对槟榔的研究显示,提取溶剂体积不同使槟榔与溶剂的接触面积不同,一定的溶剂体积可促进原花青素成分溶出,体积不断增加时部分杂质成分溶出,原花青素纯度降低。温志英等[15]对花生红衣的研究显示,原花青素为热不稳定多酚类物质,提取时间过长会破坏原花青素结构,使原花青素热分解。黄曼等[16]对高粱外种皮的研究显示,原花青素在加热时,分子运动速度随温度升高而加快,提取得率会变化,溶解、渗透速度加快,温度升高幅度明显时会使原花青素氧化,原花青素明显减少。
本研究中,比较了不同萃取条件下可可多酚原花青素的提取效果,通过单因素和响应曲面优化试验,结果表明,海南可可豆中原花青素的最佳提取工艺为浸提溶剂浓度67%、料液比1∶20（g/mL）、提取时间88 min、提取温度76 ℃。此条件下的原花青素提取得率为6.21%,高于Gu等[23]研究中4.1%的提取得率。模型分析可描述由响应面确定的原花青素提取得率,通过两两因素交互作用研究显示,溶剂浓度对原花青素提取得率的影响更为显著。提取温度和溶剂浓度对原花青素提取得率的影响相差不大。与料液比相比,提取时间和温度条件对海南可可豆中原花青素提取得率的影响较为显著。该研究的目的是确定可可豆中原花青素的最优萃取条件,经过优化的萃取工艺证明含有更多的原花青素,为海南可可豆中的原花青素的有效开发利用提供一定的借鉴基础。