胡椒（Piper nigrum）有非常重要的药用和工业价值[1,2,3]。我国胡椒的种植主要分布在海南、云南等省区,是世界第5大胡椒生产国,年产量可达4.12×104 t[4]。目前热引1号（P. nigrum cv. Reyin-1）为我国胡椒主栽品种,推广面积已经占全国90%以上。但该品种对胡椒瘟病高感染,严重时直接导致减产甚至死亡。胡椒瘟病是一种气候依赖型、传染力很强的土传性病害,主要由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leon）引起的[5]。生产上仍采取预防为主、综合防治为辅的措施,国际尚未选育出有效的抗病品种,主要用高毒化学杀菌剂,极易造成环境污染,且效果不佳[6]。胡椒主栽品种抗瘟病能力差,已成为影响包括我国在内的世界胡椒产业健康发展的瓶颈问题。
在植物体中,木质素可维持植株的机械组织（如纤维、厚壁组织）支撑力,而且可加强保护,增强植物体免受侵害[7,8,9,10]。4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（4CL）是苯丙烷代谢途径中木质素途径的重要合成酶,直接参与植物木质素的生物合成。多种植物中广泛存在4CL基因家族。目前,已经在烟草、马尾松、拟南芥、水稻等植物中进行4CL基因的克隆及表达分析[11,12,13,14,15,16]。同时4CL相关酶也被从大豆、玉米、火炬松、紫草和棉花中纯化出来[17,18]。有研究表明,调控植株木质素的含量或单体组成,可通过促进或者抑制4CL的表达来完成,从而积累或者脱除木质素[5]。对胡椒的4CL基因的研究未见相关的报道。本研究采用RACE方法从根中克隆得到了1个4CL基因,同时对该基因的生物信息学进行了分析。根据该基因的结构分析及表达模式研究可更加深入探讨该基因在胡椒根部木质素的合成作用机理及其对胡椒抗性的影响,借以深入揭示该基因在胡椒木质素合成中的分子机理,为胡椒提高抗性提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料及处理 材料主要为热引1号胡椒和黄花胡椒（Piper flaviflorum）,均采自万宁胡椒种质资源圃。胡椒扦插苗繁育及辣椒疫霉菌的针刺接种法参考范睿等[19]文献。取样后立即投入液氮,并迅速转移至-80 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 试剂及核酸测序 SMARTer RACE cDNA Amplification试剂盒购于Clontech,RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根公司,大肠杆菌DH5菌株购自TaKaRa公司,SYBR Green qRT-PCR试剂盒购于伯乐有限公司,委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成核酸测序和引物合成工作。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 总RNA及cDNA的合成均根据试剂盒说明书进行。
1.2.2 胡椒4CL基因的克隆 对胡椒转录组数据库（SRR1583631）进行收索,根据PN8.22226（B498）序列设计5°-RACE和3°-RACE基因特异引物（表1）,提取胡椒根部组织总RNA,按操作手册进行RACE 扩增5°-和3°-端cDNA片段。产物经胶回收纯化后克隆到T载体同时转化大肠杆菌感受态细胞,挑选阳性克隆菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
表1 实验所用引物序列Tab. 1 Primers used in this paper |
| 引物名称 Name of the primer | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 用途 Usage |
|---|---|---|
| B498-1(GSP1) | GTCTCCACCTCGCCGT | 5°-端第一链cDNA的合成 |
| B498-2(GSP2) | GGTGCTTCCATTGATG | 5°-端PCR第一轮扩增 |
| B498-3(GSP3) | CTTGTCCCGGTAAGCGTC | 5°-端巢式PCR第二轮扩增 |
| C358-1 | GAAAGATGAGGCAGCAGGGGAAG | 3°-端第一轮PCR扩增引物 |
| C358-2 | CAAGCAGTTCATTAGCAAGCAGGT | 3°-端第二轮PCR扩增引物 |
| QB498F1 | GCGTCTCTTCTTGTCTGC | ORF全长扩增引物 |
| QB498R1 | AAGTTTGGACGAGATACA | ORF全长扩增引物 |
| PUB-F | TTACCAGGACTCAGCAGCGAATG | qPCR内参引物 |
| PUB-R | AAGCCAATGACTTTACATCCTCCAG | qPCR内参引物 |
| 4CL-F | TGGGAAGGAGCTTGAAGAGG | 基因qPCR引物 |
| 4CL-R | ACAGGCTCATGGTCAGAACT | 基因qPCR引物 |
| PF074-F | TCGCCAAGCAGGTCAAGG | 亚细胞定位载体构建 |
| PF074-R | TCGTCGGCGCCGGACAGC | 亚细胞定位载体构建 |
1.2.3 生物信息学分析 用BlastX对序列进行比对,进行蛋白理化性质分析（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）、氨基酸序列的功能域（DNAMAN软件）、预测蛋白是否存在信号肽和亚细胞定位（https://www.predictprotein.org/）及构建同源性和系统进化树（DNAMAN软件）等生物信息学分析。
1.2.4 亚细胞定位 设计亚细胞定位载体引物 PF074-F/R（表1）,以含有目的基因的质粒为模板扩增目的条带,用In-fusion连接酶将PCR 纯化产物连接入PCAMBIA1300-35S-GFP 载体。对生长1个月左右的拟南芥野生型叶片进行原生质体制备,提取质粒后经PEG介导转入拟南芥原生质体中,Nikon C2-ER荧光共聚焦显微镜观察Pn4CL的亚细胞定位。
1.3 数据处理
基因的表达使用2-ΔΔCT方法进行定量,结果为平均值±SD。采用SPSS 20.0统计分析软件进行,以P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 Pn4CL基因RACE克隆
2.2 Pn4CL基因的序列分析
该基因全长2130 bp,包含1个完整开放阅读框,有1638 bp,5°端非编码区187 bp,3°端非编码区305 bp,一共编码545个氨基酸残基的蛋白质,起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA,核酸序列与氨基酸对应序列见图2。
图2 Pn4CL基因的推测的氨基酸序列和核苷酸序列左侧数字分别为核苷酸和氨基酸序号;第1个黑色方框表示ATG起始密码子;*表示终止密码子;单下划线表示Poly（A）加尾信号;双下划线表示poly（A）序列;第2个黑色方框区域为可能的Acyl-activating enzyme（AAE）consensus motif;第3个黑色方框区域为ATP底物结合区。 Fig. 2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Pn4CL Numbers at left means of nucleotide and amino acid. First black box represents start codon; * represents stop codon; the single underscore represents the end of Poly (A) and the double underscore represents the Poly (A) sequence. Second black box represents the possible Acyl-activating enzyme (AAE) consensus motifs, and third black box represents the ATP substrate binding regions. |
2.2 生物信息学分析
推测Pn4CL蛋白的分子式为C2660H4266N704 O789S26,编码545个氨基酸残基,相对分子质量为59.57 kDa,等电点为5.70,属于稳定蛋白。该蛋白中带正电荷的残基（Arg+Lys）为59,负电荷的残基（Asp+Glu）为66,亲水性平均数为0.628,预测为水不溶性蛋白。NCBI对其保守结构域进行分析表明,结果表明,4CL蛋白含有CaiC (Acyl-CoA synthetase)、AMP-binding、PLN02246、AFD-class I等结合域（图3）。
2.3 Pn4CL亚细胞定位
亚细胞定位预测结果显示,Pn4CL定位于细胞膜上。为了进一步研究Pn4CL的定位情况,以空载GFP为对照,在激光共聚焦显微镜下观察荧光蛋白分布,结果发现转GFP的荧光信号分布于整个细胞中,而目标基因定位于细胞膜上（图6）。
2.4 Pn4CL的表达模式分析
以PUB1为内参,用real-time PCR方法分析Pn4CL表达模式。对胡椒的根、茎、叶、花和果等不同组织下进行表达模式分析,发现Pn4CL基因在不同组织中表达差异较大,在茎中的表达量最高,其次是根部,在叶、花和果中表达量均较低（图7）。同时对不同激素处理后的荧光定量结果表明：Pn4CL表达受SA的诱导,处理24 h达到最高平,为初始水平的5.67倍（图8）;Pn4CL表达受MeJA的诱导,处理24 h表达量最高,为第0 h的5.07倍（图9）;在病原菌侵染后不同时间点进行根部cDNA取样,并作为模板来研究Pn4CL基因的表达特征,结果表明：在接菌处理前,2种不同抗性胡椒的Pn4CL表达量均较低,而在收到辣椒疫霉菌诱导后,Pn4CL基因的表达量在黄花胡椒和热引1号胡椒中都明显增加,并且随着处理时间的延长,该基因呈现出先增加后降低的变化趋势;在处理后24 h达量达到最大,随后开始下降。黄花胡椒与热引1号比较发现,除了0和4 h,黄花胡椒的表达量均大于热引1号胡椒（图10）,并且具有显著差异。
图7 不同组织中Pn4CL基因表达量不同小写字母表示不同处理间差异达5%显著水平。 Fig. 7 Different tissues on Pn4CL gene expression analysis Different lowercase letters mean significant difference at 5%. |
图8 SA处理不同时间下Pn4CL基因表达量不同小写字母表示不同处理间差异达5%显著水平。 Fig. 8 Different time of SA treatment on Pn4CL gene expression analysis Different lowercase letters mean significant difference at 5%. |
图9 MeJA处理不同时间下Pn4CL基因表达量不同小写字母表示不同处理间差异达5%显著水平。 Fig. 9 Different time of MeJA treatment on Pn4CL gene expression analysis Different lowercase letters mean significant difference at 5%. |
3 讨论
香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate-COAligase, 4CL）,可催化羟基肉桂酸酮形成肉桂酸辅酶A酯,是连接苯丙烷途径中木质素合成途径的关键限速酶,同时也是形成G-型木质素或S-型木质素单化的重要酶。本研究通过RACE法得到胡椒Pn4CL,同时进行生物信息学分析。该基因编码545个氨基酸残基的蛋白质,为水不溶性蛋白,根据亚细胞定位发现该蛋白定位于细胞膜上,4CL是木质素合成的关键酶,推测其蛋白在细胞膜上行使木质素运输等功能。NCBI对其保守结构域进行分析结果表明,4CL蛋白含有AMP-binding、CaiC、PLN02246、AFD-class I等结合域。该基因在被子植物、裸子植物和蘇类植物中被广泛研究,如白毛杨、马尾松、杨树、落叶松、拟南芥[11,12,13,14,15,16,17]等。胡尚连等[12]克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1674 bp,可编码558个氨基酸,有2个4CL氨基酸保守域存在。
由于SA、JA是植物抗病信号途径中2种重要的植物激素,而木质素是参与植物抗病响应的重要物质。本研究发现,SA和JA处理后均会诱导Pn4CL基因的表达。同时已有研究报道SA、JA处理烟草幼苗不仅可以提高幼苗抗病性,还能提高幼苗的过氧化物酶活性和木质素的含量[24]。本研究还发现,胡椒Pn4CL基因在辣椒疫霉菌侵染下表达量出现了升高,在24 h达到最高值,其原因可能是病原菌的侵染调节了Pn4CL的转录,使Pn4CL蛋白维持在相应的水平。其结果说明Pn4CL基因参与调控胡椒瘟病的抗性。另外,本研究发现,胡椒不同抗性种质受辣椒疫霉菌侵染后表达存在差异,接种后抗病种质的表达量都略高于感病种质。这说明Pn4CL基因的表达模式在不同抗性水平的胡椒种质中也存在一定的差异。目前,对在植物中被病原体感染、辐射等外界刺激所激活而表达4CL基因的研究很多。经过茉莉酸、伤害胁迫处理欧芹的成熟叶片,均瞬间高丰度增加4CL的mRNA[25]。Uhlmann等[26]用晚疫病菌（Phytophthora infestans）感染马铃薯叶片,4CL酶活性在接种12 h 后增加2倍。同时用致病寄生真菌（Peronos poraparasitica）的孢子感染拟南芥子叶[27],发现该致病真菌强烈诱导At4CL1和At4CL2 mRNA的表达。上述研究结果表明,4CL基因都在病原菌侵染下均能提高表达来改变植物体内木质素的合成,是较为理想的目标基因。本研究中胡椒Pn4CL基因的克隆及表达为开展Pn4CL功能分析与胡椒抗病育种提供新思路。