龙眼（Dimocarpus longan Lour.）原产于中国华南地区,是无患子科（Sapindaceae）一种重要的热带经济果树。世界上许多热带和亚热带国家均有龙眼的种植和生产,比如澳大利亚及越南、泰国等东南亚国家[1]。中国龙眼的栽培面积和产量一直稳居世界首位,并且在整个世界龙眼产业经济中占有极重要的地位。
龙眼在中国已有2000年以上的栽培历史,我国拥有丰富的龙眼种质资源,同时也积累了先进的栽培、管理技术[2]。然而,实际生产中仍然有很多问题限制着龙眼产业的发展。其中,成花难所导致的产量不稳定是最主要的问题[3]。龙眼成花诱导需要合适的外界环境条件,比如一段时间的低温（春化作用）,合适的土壤盐度及干燥条件等。若成花诱导关键时期出现高温,即便花原基已经形成,龙眼花芽也会转变成为叶芽,即“成花逆转”,从而造成减产,出现龙眼生产的“大小年”现象,严重打击果农的生产积极性和龙眼产业的健康发展。在实际生产中,人们常利用一些化学试剂（比如KClO3）来实现龙眼花期调控。然而,这些化学试剂的效果因施用地区和品种的不同而差异很大[4,5]。因此,解析龙眼成花调控分子机制才是解决该问题的根本途径。前人对不断成花的‘四季蜜’和正常开花的‘石硖’龙眼进行了对比转录组测序,初步解析了‘四季蜜’龙眼特异成花诱导机制,同时发现一些转录因子特异参与该过程,比如WRKY等[6]。
WRKY是高等植物的第7大转录因子家族,广泛参与植物的生长发育及对各种逆境胁迫响应过程[7]。该基因家族编码的蛋白均含有2个保守的结构域,1个是N-端的由近60个氨基酸组成的WRKY结构域,另1个是C-端的锌指结构。这两者是WRKY特异性与启动子中的W-box序列（C/T）TGAC(T/C)结合所必不可少的组件。根据WRKY结构域的数目及锌指结构序列的特点,WRKY蛋白可被划分为3个主要类型[8]。已有的研究表明,WRKY参与植物的成花调控。比如,拟南芥的过表达GsWRKY20、MlWRKY12和WRKY71株系都表现出早花现象[9,10,11]。AtWRKY12和AtWRKY13则可通过GA3来影响拟南芥在短日照条件下的成花时间。wrky12和wrky13转基因植株分别表现为迟花和早花现象[12]。然而,目前关于WRKY基因参与植物成花的研究报道还较少,大部分研究还集中在WRKY基因对各种逆境胁迫的响应。作为转录因子,WRKY蛋白可通过对细胞内特定基因的转录调控来应答不同的外界胁迫。比如,拟南芥和水稻的许多WRKY基因都参与植物对高盐、干旱、高温和低温等非生物逆境胁迫[13,14,15,16,17]。过表达OsWRKY47则会增加转基因植株的产量和对干旱胁迫的响应[18]。
前期对龙眼的WRKY家族基因进行了全基因组水平的系统分析,共在龙眼基因组中鉴定出55个DlWRKY基因[19]。RNA-seq分析结果表明,一些DlWRKY基因参与了龙眼成花诱导过程及对逆境胁迫的响应,比如DlWRKY52基因。本研究将进一步对该基因进行克隆、亚细胞定位分析,同时通过qRT-PCR对DlWRKY52基因在不同器官、花、果发育过程及响应不同逆境胁迫的表达规律进行研究,初步解析DlWRKY52基因的功能。
1 材料与方法
1.1 材料
选取3组在中国热带农业科学院南亚热带作物研究所龙眼种质圃中长势和树龄（9 a龄）一致的‘四季蜜’龙眼和主栽品种‘石硖’龙眼为取样树,其中‘石硖’龙眼同其他栽培品种一样表现为季节性开花（seasonal flowering, SF）。其成花需要经过一段时间的低温诱导（即“春化”）才能启动,1年一般只能开花、结果1次。而‘四季蜜’龙眼具有不断成花特性（perpetual flowering, PF）,可1年4季不断进行成花诱导和结果,休眠芽、花和果实可以存在于同一枝条上,其成花诱导不受外界环境影响。其是研究龙眼成花诱导分析机制的优异材料。本研究选择3个成花诱导关键时期的顶芽进行取样。这3个时期分别为：休眠期（T1）,这个时期的顶芽还未萌动,水分含量很少,硬度高;“红点”时期（T2）,此时的顶芽已经开始萌动发育成花序,芽轴伸长,最显著的特征是其基部的腋芽膨大,变为红色（俗称“红点”）;第1花序时期（T3）,此时顶芽已经完全发育成花序,但未开花。分别在2016年11月20日、2016年12月24日和2017年1月1日采集T1、T2及T3时期的顶芽,以进行成花诱导表达分析;取‘四季蜜’龙眼的花、花芽、叶、果皮、果肉、根、种子、茎和幼果（花后60 d整果）等器官为材料进行组织表达分析;取花后60、70、80、90和100 d的龙眼果肉为材料进行果实发育分析。所有的试验设3次重复,取样后立即放入液氮速冻并转入-80 ℃冰箱中保存、备用。
1.2 DlWRKY52基因序列的克隆及生物信息分析
从龙眼基因组数据库（NCBI Sequence Read Archive, SRA315202）中获得DlWRKY52基因（Dlo 001658.1）的碱基序列和氨基酸序列信息。利用Primer Premier 5.0,根据DlWRKY52 基因的ORF序列设计引物W52-S和W52-A（表1）,委托天一辉远生物科技有限公司（广州）合成。用北京华越洋生物公司的植物RNA提取试剂盒提取‘四季蜜’龙眼叶片的RNA,采用TaKaRa公司的PrimeScript RT-PCR试剂盒反转录cDNA后作为模板,具体操作步骤参照说明书。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环（变性-延伸）;72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存。扩增完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的基因片段进行切胶回收和纯化。然后将纯化的目的基因片段连接到pMD18-T载体上,利用热击法转化DH5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,挑取阳性单克隆送天一辉远生物科技有限公司（广州）进行测序。
表1 所用引物信息Tab. 1 Information of primers used |
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Primer seqence (5°-3°) | 用途 Application | PCR扩增片段大小 Size of PCR product/bp |
|---|---|---|---|
| W52-S | ATGGACATAAAAGAAGCTGTGG | 基因克隆 | 918 |
| W52-A | CTACTCTTCTTTTAGCATATGT | ||
| qW52-S | CTGTGGAGATGGATGGTGGT | 荧光定量PCR | 235 |
| qW52-A | TCCATCTTCGTGACAGCAGT | ||
| ProW52-S | CAGTGGTCTCACAACATGGACATAAAAGAAGCTGT | 亚细胞定位 | 948 |
| ProW52-A | CAGTGGTCTCATACACTCTTCTTTTAGCATATGTG | ||
| Actin-S | ATTGTTGAGCAGCTTGTCCG | Actin | 250 |
| Actin-A | GGAACACAACTTTGGCGAGT |
利用在线软件SMART程序（http://smart.emblheidelberg.de/）预测蛋白结构域,利用ExPASy（http://expasy.org/tools/）分析蛋白的等电点和分子量。根据克隆所得的cDNA序列,利用BLASTp对氨基酸序列进行同源性对比,同时利用MEGA 5软件进行氨基酸序列同源性分析及系统发育分析,构建Neighbor-Joining进化树,1000 次重复,其它均为默认设置。
1.3 表达分析
qRT-PCR反应所用仪器为Roche的LightCycler 480,PCR反应酶为TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。反应体系为20 mL,其中模板cDNA 40 ng,上、下游引物各250 nmol/L,SYBR Green Master Mix 10 μL,其余用ddH2O补齐。反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 10 s,59 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,40个循环后作熔解曲线（95 ℃→65 ℃,0.1 ℃/s）。利用2-ΔΔCT计算DlWRKY52基因的相对表达量。所有样品进行3次重复,均设阴性对照。采用Excel软件进行平均数统计,以SPSS 17.0软件进行单因素方差分析目的基因在不同组织和材料里的变化的差异显著性（P<0.05）,并使用SigmaPlot 12.5软件作图。
1.4 亚细胞定位分析
根据克隆所得的DlWRKY52基因序列设计引物（去除终止子）（表1）,扩增带有酶切位点（EcoRⅠ）的DlWRKY52的ORF全长,PCR反应程序如上。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后连接pMD18-T载体上,转化DH5α。挑取单菌落,经PCR检测后提质粒测序。然后分别对pBWA(V)HS-osgfp DlWRKY52质粒用EcoRⅠ进行酶切,回收后进行酶连。将酶连后的质粒转入大肠杆菌DH5α,阳性检测后挑选正确的菌株测序,然后提取得到pBWA(V)HS-DlWRKY52-osgfp质粒。接着通过PEG介导法转入拟南芥的原生质体中[20]。28 ℃暗培养24~48 h用激光共聚焦显微镜观察。同时以pBWA(V)HS-osgfp空载作为对照。
2 结果与分析
2.1 DlWRKY52基因的克隆及生物信息学分析
利用BLASTp对DlWRKY52的氨基酸序列进行同源性检索,然后利用MEGA 6.0软件构建系统进化树（图3）。结果表明,DlWRKY52与双子叶植物的WRKY聚类到一起,其中与柑橘（Citrus sinensis）的CsWRKY23（XP_006492359.1）亲缘关系最近,而与单子叶植物的WRKY亲缘关系较远,比如水稻（Oryza sativa）的OsWRKY23 (DAA05088.1)。
2.2 DlWRKY52基因组织表达特性分析
qRT-PCR结果表明DlWRKY52基因在被检测的9种龙眼组织中都有表达,其中在叶片中表达量最高,在幼果、茎和果皮中的表达次之（图4）。
2.3 DlWRKY52基因在花、果发育过程中的表达模式
利用qRT-PCR技术,本研究分析了DlWRKY52在‘四季蜜’和‘石硖’龙眼3个成花阶段的表达。结果表明,DlWRKY52在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达,T2时期仅为T1时期的1/5。而在‘石硖’龙眼成花诱导过程中DlWRKY52的表达水平未出现显著性差异表达（图5）。
2.4 DlWRKY52亚细胞定位分析
为检测DlWRKY52蛋白在细胞中的定位,本研究构建了含有增强型绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白表达载体（35S：DlWRKY52-GFP）,通过PEG介导法转入拟南芥叶肉原生质体细胞里,并用激光共聚焦显微镜进行观察。如图7所示,在480 nm波长的激化下,35S：DlWRKY52- GFP只在细胞核里有荧光信号,细胞质和细胞膜中均无GFP信号,而35S：GFP对照组则在整个细胞中都能观察到GFP信号,没有明确的定位。该结果表明,DlWRKY52蛋白可能定位于细胞核上。
图7 DlWRKY52蛋白在拟南芥叶肉原生质体中的亚细胞定位GFP：绿色荧光蛋白;Chloroplast：叶绿体自发荧光;Bright：明场;Merged：2种荧光与明场融合;标尺为10 μm。 Fig. 7 Subcellular localization of DlWRKY52 protein in the Arabidopsis mesophyll protoplasts GFP: Green fluorescent protein; Chloroplast: Chloroplast autofluorescence; Bright: Bright field; Merged: Fusion of two kinds of florescence; Scaleplate was 10 μm. |
3 讨论
成花是植物生命进程中的一个重要事件,直接决定着作物的种子或果实产量[21]。研究成花诱导的遗传机制、挖掘成花相关基因,对于果树的花期调控和增产具有重要意义。
目前,植物的成花分子遗传机制研究多集中在模式植物上,而在果树中还未取得突破性进展。拟南芥中至少存在5条主要的成花通路,包括光信号途径、春化途径、自花途径、赤霉素途径及年龄途径[22]。通过FT（FLOWERING LOCUS T）、FLC（FLOWERING LOCUS C）和CO （CONSTANS）等成花相关基因以及MADS-domain、NACs、MYBs等转录因子的介导,这些通路形成一个复杂的调控网络,最终实现对成花转变的激活或抑制。作为成花植物的一类重要转录因子,WRKY可以通过保守结构域（WRKYGQK）结合下游基因启动子中的W-box核心序列（T）TGACC（A/T）特异性结合来激活或者抑制植物的成花[6]。比如,AtWRKY71可通过直接与FT、LFY和AP1启动子区域的W-boxes结合来影响植物的成花[9]。AtWRKY12和AtWRKY13则通过调控FUL表达在短日照下调控拟南芥开花[12]。AtWRKY75也是通过直接激活FT来促进拟南芥开花[23]。有趣的是,这些模式植物的基因均属于WRKY转录因子的Group IIc。本研究的DlWRKY52含有典型的WRKY结构域及C2H2型锌指结构,与AtWRKY71等基因一样也属于Group IIc。表达分析表明,DlWRKY52只在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达,而在‘石硖’龙眼成花诱导过程中未出现显著性表达差异,说明DlWRKY52特异参与了‘四季蜜’龙眼成花诱导早期调控过程,并起到负调控的作用。与其他WRKY转录因子一样[24,25,26,27],DlWRKY52蛋白定位于细胞核上,说明DlWRKY52蛋白对龙眼成花诱导调控发生在细胞上。但DlWRKY52究竟是通过与哪些成花基因互作及哪些成花通路来调控‘四季蜜’的成花诱导?还需要进一步研究。