荔枝是一种营养价值较高的水果,是食疗的佳品,因富含酚类物质[1]而闻名,在全世界被广泛种植。据统计,2010年荔枝的全球种植面积高达70万hm2[2],总产量有160万t[3]。我国是荔枝产出大国,种植地主要分布在广东、广西、海南和福建等省份,而广东省荔枝的种植面积和产量占全国的98%以上[4]。荔枝种植分布范围广,由于地理位置和气候条件的不同等,导致荔枝的品种也很多,特异性差异也比较大。目前,在我国种植的荔枝品种就有200多种。据统计,2013年我国商业性种植的荔枝品种中,其生产规模从大到小排名为‘黑叶’、‘妃子笑’、‘槐枝’、‘桂味’、‘白糖罂’、‘白蜡’、‘鸡嘴’、‘玉荷’、‘糯米糍’等[5]。
荔枝产量大,在加工过程中也会产生大量的果皮废弃物,且荔枝果皮不能直接作为食品用。但其中含有丰富的酚类物质,此类物质具有抗氧化、抗诱变、抗病毒等调节动物细胞的生理功效[6]。不仅如此,荔枝果皮作为药材还具有除湿止痢、止血作用,主治痢疾、血崩、湿疹,降血脂、抗心血管疾病[7]和抗癌[8,9]等。荔枝果皮作为废弃物被丢弃,必然导致资源的浪费,并造成一定的环境问题[10]。
国内外已有不少学者在探究荔枝果皮酚类物质组成。Jiang等[11]通过HPLC分离纯化得到的荔枝果皮多酚提取物的10个成分群,并从中通过核磁共振和质谱确证出8个酚类物质。马青[12]利用多种色谱分离方法,从荔枝果皮乙醇提取物中分离出31个化合物,而且部分单体酚表现出较强的清除自由基能力。Sun等[13]研究结果表明,荔枝果皮中单体酚表儿茶素、花青素和原花青素二聚体有良好的清除自由基能力。以上研究结果表明,荔枝果皮具有很大的利用价值。
荔枝果皮提取物作为食用或者药用将会有很大的发展前景。我国荔枝果皮资源丰富,关于不同品种荔枝果皮酚类物质的比较研究未见报道。因此,本研究用80%甲醇分别提取6个品种荔枝果皮中的酚类物质,测定其总酚和总黄酮含量,并比较其差异。将为选取最适品种进行种植从而提供优质废弃荔枝果皮进行开发利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 荔枝：‘鸡嘴’、‘荔枝王’、‘桂味’、‘玉荷’、‘糯米糍’和‘桂红’共6个品种的荔枝果皮,其中,‘鸡嘴’、‘桂味’、‘玉荷’和‘糯米糍’均属于商业化品种[5]。新鲜采样,选择成熟、鲜红和大小均匀的荔枝进行实验,各个品种样本量约5 kg,以上荔枝果皮均采用人工剥皮并用自来水冲洗干净,然后通过电热恒温鼓风干燥箱于60 ℃干燥至水分含量8%以下,机械粉碎后过40目筛,混合均匀后采用密封袋分装,干燥器中常温保存。
没食子酸（gallic,98.5%）、芦丁（rutin,98%）、Trolox（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethy lchroman- 2-2carboxylic acid,98%）由上海源叶生物科技有限公司提供;咖啡酸（caffeic acid,99%）、阿魏酸（ferulic acid,99%）、原花青素B2（procyanidin B2,98%）、表儿茶素（epicatechin,98%）、A型原花青素三聚体（A-type procyanidin trimer,98%）、原花青素A2（procyanidin A2,98%）、槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷（quercetin-3-rutinose-7-rhamnoside,98%）和异槲皮素（isoquercitrin,98%）购自Sigima-Aldrich公司;ABTS（98%）、TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine,99%)、硫酸亚铁（99%）由西亚试剂公司提供;福林酚试剂（Folin-Ciocalteu试剂,BR）由麦克林试剂公司提供;色谱纯乙腈和乙酸由天津科密欧化学试剂有限公司提供;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备 WK-400B型高速药物粉碎机,山东青州市精诚机械有限公司;UV-2100型紫外可见光分光光度计,北京瑞利分析仪器公司;XW-80A型漩涡混合仪,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;THZ-82型水浴恒温振荡器,金坛市华欧实验仪器厂;KH3200DE型数控超声波清洗器,北京金科利达电子科技有限公司;GL124-1SCN型电子天平,德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;GL-2050MS型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;HPLC-DAD 1260型高效液相色谱仪,该仪器配备有4元件泵（G1311C 1260 Quat泵VL）输送系统、自动采样器（G1329B 1260ALS）和DAD检测器（G1315D DAD）,美国Agilent公司。
1.2 方法
1.2.1 甲醇提取 称取各个样品粉末1.00 g,按照料液比1:30（m/v）混匀于50 mL塑料离心管中,用漩涡振荡器混匀后置于超声波清洗机中进行提取,设置超声功率100 W,水温30 ℃,超声提取15 min,提取液置于离心机中以5000 r/min离心10 min后收集上清液,再加入20 mL 80%甲醇于离心管中,再次用漩涡振荡器混匀后按照上述方法重复提取1次,于离心机再次离心后合并2次上清液,混匀,分别收集于10 mL离心管中,-20 ℃冰箱冷冻保存备用。
1.2.2 总酚含量测定 采用福林酚法测定不同荔枝果皮中的总酚含量,具体方法参考Hossain等[14]并适当修改。用移液枪准确移取250 μL适当稀释后的样品或标准品于试管中,然后向试管中加入1.0 mL蒸馏水和250 μL福林酚试剂,用漩涡振荡器混匀,静置6 min后加入质量浓度为7%的碳酸钠溶液2.50 mL,再加入2.00 mL蒸馏水补足6.00 mL,用漩涡振荡器混匀后,放入暗箱中室温条件下反应90 min,用紫外可见分光光度计测定其在760 nm的吸光度值。以吸光度（y）为纵坐标,溶液中没食子酸浓度（x）为横坐标,进行回归分析,得出的标准曲线为y = 0.004x + 0.056,相关系数R2 = 0.998,荔枝果皮总酚含量以没食子酸当量计,单位mg/g。
1.2.3 总黄酮含量测定 荔枝果皮中的总黄酮含量测定方法,参考Hossain等[14]并适当修改。样品或标准品作一定的稀释后,用移液枪准确移取样品或标品600 μL和质量浓度为5%的亚硝酸钠溶液180 μL于试管中,然后向试管中加入3.00 mL蒸馏水,用漩涡振荡器混匀,静置6 min后加入质量浓度为10%的六水合氯化铝溶液360 μL,再用漩涡振荡器混匀,室温条件下反应5 min后再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液1.20 mL,最后加入0.66 mL蒸馏水补足6.00 mL,用紫外可见分光光度计测定其在510 nm的吸光度值。以吸光度（y）为纵坐标,溶液中芦丁浓度（x）为横坐标,进行回归分析,得出的标准曲线为y=0.001x-0.004,相关系数R2=0.997,荔枝果皮总黄酮含量以芦丁当量计,单位为mg/g。
1.2.4 抗氧化活性分析 采用FRAP铁离子还原能力的测定作为抗氧化活性分析的方法之一,具体测定方法参考Thaipong等[15]并适当修改。
FRAP储备液制备：其中包括300 mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L六水氯化铁溶液,把以上3种溶液按照10:1:1的体积比充分混匀后放入37 ℃水浴锅中孵育待用。注意,该工作液配置后必须在1~ 2 h内使用完毕。
吸取稀释后样品或标品0.3 mL于试管中,并加入2.7 mL FRAP工作液,漩涡振荡器混匀后放入暗箱中室温反应30 min,用紫外可见分光光度计测定其在593 nm的吸光度值。以吸光度（y）为纵坐标,溶液中硫酸亚铁浓度（x）为横坐标,进行回归分析,得出的标准曲线为y=2.010x+ 0.081,相关系数R2=0.999,计算各样品的FRAP抗氧化能力,FRAP 抗氧化值以硫酸亚铁当量计,单位为μmol/g。
采用ABTS+自由基离子清除能力的测定作为抗氧化活性分析的方法之2,具体测定方法参考Thaipong等[15]并适当修改。
ABTS工作液配制：其中包括2.6 mmol/L的高硫酸钾溶液和7.4 mmol/L的ABTS溶液,把以上2种溶液按照1:1的体积比混合,用漩涡振荡混匀后暗箱中室温反应12 h。使用该工作液时应加入甲醇稀释40~50倍至用紫外可见分光光度计测其波长在734 nm吸光度值为0.70±0.02。
吸取样品或标品0.1 mL于试管中,并加入ABTS工作液2.9 mL,用漩涡振荡混合后静置反应6 min,用紫外可见分光光度计测定其在734 nm的吸光度值,计算清除率,公式为：清除率= (A0-A)/A0×100%,其中A0为稀释后工作液吸光度值,A为样品吸光度值。
以清除率（y）为纵坐标,溶液中Trolox浓度（x）为横坐标,进行回归分析,得出的标准曲线为y = 1.556x-0.034,相关系数R2 = 0.996,计算各样品的ABTS抗氧化能力,ABTS抗氧化值以Trolox当量计,单位为μmol/g。
1.2.5 单体酚类物质含量的测定 用注射器吸取适量的样品过0.45 μm滤膜后使用安捷伦1260型HPLC-DAD系统仪器进行高效液相色谱分析。荔枝果皮甲醇提取物中酚类化合物的成分通过参考Su等[16]进行测定。色谱分离在250 mm× 4.6 mm,5 μm的Zorbax SB-C18柱上进行。以乙腈（A）和0.4%冰乙酸（B）为流动相,在30 ℃的柱温条件下,以1.0 mL/min的流速和20 μl的进样量进行分析。梯度洗脱程序为：0~40 min,5%~25%;40~45 min,25%~35%;45~50 min,35%~50%,检测波长为280 nm。所有溶剂均为高效液相色谱级,峰面积用于定量分析。结果以mg/g荔枝果皮表示,每个品种3次重复,以平均值±标准差表示。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次,结果以平均值±标准差（mean ± SD）表示。使用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析,并且以S-N-K检验比较各品种之间的差异显著性,以Origin 7.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 甲醇提取不同品种荔枝果皮总酚含量差异分析
由图1可知,不同品种的荔枝果皮总酚含量差异显著,其中以‘荔枝王’总酚含量最高,‘鸡嘴’最低,‘荔枝王’的总酚含量比‘鸡嘴’的总酚含量多出138.68%（P<0.05）。商业化品种中‘糯米糍’果皮总酚含量最高且较‘鸡嘴’高出53.73%（P<0.05）。方差分析结果表明,‘桂味’和‘玉荷’的总酚含量并无显著性差异（P>0.05）。
2.2 甲醇提取不同品种荔枝果皮总黄酮含量差异分析
由图2可以看出,荔枝果皮总黄酮含量与总酚含量结果类似,‘荔枝王’果皮的总黄酮含量最高,‘鸡嘴’最低。方差分析结果表明,‘桂味’和‘玉荷’间总黄酮含量存在显著性差异（P<0.05）。不同品种荔枝果皮中总黄酮的含量具体顺序如下：‘荔枝王’>‘桂红’>‘糯米糍’>‘玉荷’>‘桂味’>‘鸡嘴’。商品化品种中总黄酮含量最高的是‘糯米糍’。不同品种荔枝果皮之间的总黄酮含量均存在显著差异（P<0.05）。
2.3 甲醇提取不同品种荔枝果皮FRAP抗氧化能力差异分析
由图3可知,不同品种的荔枝果皮FRAP抗氧化能力有不同程度差异,抗氧化能力以‘荔枝王’最高,‘鸡嘴’最低。‘玉荷’与‘桂味’、‘玉荷’与‘糯米糍’之间的抗氧化能力并无显著差异（P>0.05）,6个品种的抗氧化能力变幅范围为(259.58±26.70)~(546.31±10.80)μmol /g。
2.4 甲醇提取不同品种荔枝果皮ABTS抗氧化能力差异分析
由图4可知,‘鸡嘴’、‘桂味’和‘玉荷’的荔枝果皮之间的ABTS自由基清除能力并无明显差异（P>0.05）。‘玉荷’和‘糯米糍’的荔枝果皮之间的ABTS自由基清除能力也并无明显差异（P>0.05）。‘桂红’与‘荔枝王’的FRAP抗氧化能力差异显著（P<0.05）,但在ABTS抗氧化能力中与‘荔枝王’相差不大。ABTS抗氧化能力排序为：‘荔枝王’>‘桂红’>‘糯米糍’>‘玉荷’>‘桂味’>‘鸡嘴’。
2.5 不同品种荔枝果皮单体酚类物质组成差异分析
由图5可知,‘糯米糍’是1个具有代表性的商业化品种,通过对比色谱峰与标准品的保留时间,确定‘糯米糍’荔枝果皮中含有咖啡酸、原花青素B2、表儿茶素、A型原花青素三聚体、槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷、阿魏酸、异槲皮素和原花青素A2。
图5 甲醇提取糯米糍荔枝果皮酚类物质的HPLC色谱图1：咖啡酸;2：原花青素B2;3：表儿茶素,4：A型原花青素三聚体;5：槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷;6：阿魏酸;7：异槲皮素;8：原花青素A2。 Fig. 5 Extraction of phenolic substances from lychee pericarp with methanol by high performance liquid chromatography 1: Caffeic acid; 2: Procyanidin B2; 3: Epicatechin; 4: A-type procyanidin trimer; 5: Quercetin-3-rutinose-7-rhamnoside; 6: Ferulic acid; 7: Isoquercitrin; 8: Procyanidin A2. |
由表1可以看出,‘鸡嘴’和‘桂味’经甲醇提取后不含或只含有极少的咖啡酸和阿魏酸。‘桂味’中的表儿茶素含量与其他品种差异显著（P < 0.05）。A型原花青素三聚体和槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷的含量在各个品种中的排名一样,为‘桂红’>‘荔枝王’>‘糯米糍’>‘玉荷’>‘桂味’>‘鸡嘴’。不同品种荔枝果皮中原花青素A2的含量均呈显著性差异（P<0.05）。6个荔枝品种中,‘荔枝王’中异槲皮素的含量最高,为(0.38±0.01)mg/g。已被鉴定出的这8种单体酚在‘糯米糍’品种中含量变幅范围为(16.11±0.59)~ (0.12±0.00)mg/g,其中原花青素A2最高,咖啡酸最低。
表1 不同品种荔枝果皮之间单体酚类物质组成的差异Tab. 1 The differences of monomer phenolic composition in different varieties of lychee pericarp (mg∙g-1) |
| 单体酚 Monomer phenolic | 鸡嘴 Jizui | 荔枝王 Lizhiwang | 桂味 Guiwei | 玉荷 Yuhe | 糯米糍 Nuomici | 桂红 Guihong |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 咖啡酸 | NDa | 0.11±0.06c | NDa | 0.07±0.00b | 0.12±0.00c | 0.18±0.01d |
| 阿魏酸 | NDa | NDa | NDa | 0.49±0.05b | 1.15±0.05c | NDa |
| 原花青素B2 | NDa | 1.04±0.22c | 0.51±0.07b | 1.55±0.03d | 1.77±0.05e | 2.25±0.06f |
| 表儿茶素 | 0.17±0.01a | 0.15±0.01a | 0.24±0.01b | 0.16±0.01a | 0.15±0.01a | 0.16±0.01a |
| A型原花青素三聚体 | 0.93±0.14a | 3.38±0.08d | 1.55±0.07b | 1.59±0.05b | 3.06±0.09c | 4.05±0.05e |
| 原花青素A2 | 11.72±0.44a | 33.05±0.11f | 12.52±0.42b | 18.47±0.48d | 16.11±0.59c | 25.80±0.20e |
| 槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷 | NDa | 1.90±0.05e | 0.81±0.03b | 1.04±0.02c | 1.49±0.05d | 2.21±0.26f |
| 异槲皮素 | 0.22±0.00a | 0.38±0.01d | 0.24±0.00a | 0.31±0.01b | 0.36±0.03cd | 0.34±0.02c |
Note: Value in dry weight; ND means not detected; Different lowercase letters in the same row indicate significant difference at 0.05 level among different varieties. | |
注：数值以干重计;ND表示未检测到;同行不同小写字母表示不同品种在0.05水平上存在显著差异。 |
2.6 荔枝果皮酚类物质含量与其抗氧化活性相关性分析
由表2可看出,荔枝果皮中总酚含量（TPC）、总黄酮（TFC）、FRAP和ABTS 4者之间各自的相关系数均大于0.8,表现为极强相关,且总酚含量与总黄酮含量和FRAP抗氧化能力之间的相关系数大于0.9。总黄酮与FRAP、ABTS之间的相关系数比总酚含量与FRAP、ABTS之间的要大。总酚含量与总黄酮含量有最高的相关系数,说明总黄酮含量越大,总酚含量也就越大。
表2 荔枝果皮酚类物质含量与其抗氧化活性相关性分析Tab. 2 Analysis of the correlation between phenolic substance content and antioxidant activity in lychee pericarp |
| 项目Item | TPC | TFC | FRAP | ABTS |
|---|---|---|---|---|
| TPC | 1 | |||
| TFC | 0.98 | 1 | ||
| FRAP | 0.95 | 0.96 | 1 | |
| ABTS | 0.88 | 0.90 | 0.88 | 1 |
Note: very strong correlation (0.8-1.0); strong correlation (0.6-0.8), moderate correlation (0.4-0.6). | |
注：极强相关（0.8~1.0）;强相关（0.6~0.8）;中等程度相关（0.4~0.6）。 |
3 讨论
水果果皮中含有丰富的酚类物质,具有良好的抗氧化、抗炎和抑菌等活性[17],是水果中发挥抗氧化作用的一类重要支撑物质。总酚和总黄酮含量是体现抗氧化能力的重要指标,但即使是同一植物不同品种中酚类物质组成也会各有不同[18]。植物生长所处环境和基因的差异会导致同一植物不同品种之间的酚类物质含量、组成和抗氧化活性均呈不一样的差异[19]。周生茂[20]对不同品种山药进行研究发现,由于各品种之间基因型的差异,导致各个品种之间的酚类物质含量均不尽相同。冯立娟等[21]采用常规品质的分析方法和高效液相色谱技术对8种石榴品种果实进行分析,发现石榴中的酚类物质与其抗氧化能力存在显著差异。温靖等[22]通过常规分析方法对广东省17个不同荔枝品种果实的品质进行比较。而关于不同品种荔枝果皮酚类物质的比较研究未见报道。为探究其差异性,对不同品种荔枝果皮之间酚类物质进行研究,结果显示6个荔枝品种果皮中总酚含量与总黄酮含量从多到小的排序均是：‘荔枝王’>‘桂红’>‘糯米糍’>‘玉荷’>‘桂味’>‘鸡嘴’。S-N-K检验结果表明,6个荔枝品种果皮中的酚类物质含量呈显著性差异,其总酚含量的变幅范围为28.69~68.48 mg/g。其结果与Kubola等[23]研究结果相一致。以上结果说明,水果在生长的过程中,由于基因差异等原因,所积累的酚类物质含量也不一样。
为尽可能地分离酚类物质,刘新等[31]通过铁盐催化比色法和HPLC分析得出,荔枝果皮中的黄烷-3-醇类成份分别为原花青素、没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯。其中原花青素和表儿茶素与本研究HPLC分离鉴定甲醇提取荔枝果皮酚类物质的结果相一致。黄酮类化合物和酚酸类物质大部分都已被证实具有良好的抗氧化活性[32]。Liu等[33]研究表明,荔枝果皮中的A型原花青素二聚体和A型原花青素三聚体的抗氧化能力较表儿茶素强,其原因可能是与其分子结构中的羟基数量有关。而本研究中,通过比较荔枝果皮中单体酚含量,其结果表明,A型原花青素二聚体和A型原花青素三聚体的含量均较表儿茶素高,说明总羟基数量越多,抗氧化能力越强。Gong等[8]研究发现,从荔枝果皮中分离出B型和复杂的a/B型表儿茶素三聚体,且证实酚类物质中的羟基的数量越多,其抗氧化性和抗癌活性越强。本研究以甲醇提取6个荔枝品种果皮中的酚类物质,呈现出抗氧化能力不一,其原因有可能是上述酚类物质含量或者种类不一。同时,不同品种荔枝果皮的酚类物质含量和种类差异不一的原因,有待进一步确切的研究。
4 结论
采用甲醇提取的方法,分析6个品种荔枝果皮中酚类物质含量与种类及其抗氧化活性,研究结果发现,不同荔枝品种果皮中的总酚、总黄酮含量及其FRAP抗氧化能力和ABTS自由基清除能力存在显著差异。6个荔枝品种中,‘荔枝王’的总酚和总黄酮含量最高,其抗氧化能力最强。而在测定的4个商业化品种（‘鸡嘴’、‘桂味’、‘玉荷’和‘糯米糍’）中,‘糯米糍’的总酚和总黄酮含量最高,其抗氧化能力最强。鉴定出荔枝果皮中的8种单体酚,分别为咖啡酸、原花青素B2、表儿茶素、A型原花青素三聚体、槲皮素-3-芦丁糖-7-鼠李糖苷、阿魏酸、异槲皮素和原花青素A2。各个品种之间的酚类物质含量与抗氧化能力之间存在显著的相关性,表明荔枝果皮中的酚类物质是其发挥抗氧化活性的重要物质基础。