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2020 , Vol. 41 >Issue 3: 529 - 537

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.015

生物技术与组织培养

基于瓠瓜转录组测序的EST-SSR标记的开发及其应用

  • 许端祥 ,
  • 杜文丽 ,
  • 陈中钐 ,
  • 赵瑞丽 ,
  • 徐同伟 ,
  • 高山 , *
展开
  • 福州市蔬菜科学研究所,福建福州 350111
高 山, E-mail： 。

许端祥（1974—）,男,硕士,副研究员,研究方向：蔬菜育种及生物技术。

收稿日期: 2019-07-18

  要求修回日期: 2019-08-28

  网络出版日期: 2020-04-16

基金资助

福建省星火项目(2018S0004)

福建省农业科技重大专项专题项目(2018NZ0002-3)

版权

版权所有，未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
收起

EST-SSR Marker Development and Utilization Based on Transcriptome of Lagenariasiceraria (Mol.) Stand.

  • XU Duanxiang ,
  • DU Wenli ,
  • CHEN Zhongshan ,
  • ZHAO Ruili ,
  • XU Tongwei ,
  • GAO Shan , *
Expand
  • Fuzhou Institute of Vegetable Science, Fuzhou, Fujian 350111, China
GAO Shan, E-mail： 。

Received date: 2019-07-18

  Request revised date: 2019-08-28

  Online published: 2020-04-16

Copyright

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Fold

摘要

为丰富瓠瓜分子标记库、开发瓠瓜SSR标记、寻找有效的瓠瓜种质资源鉴定方法,利用MISA软件对瓠瓜转录组测序获得的87 518条unigene序列进行筛选,共检测出11 029个SSR位点,发生频率为9.85%,分布距离为平均每8.3 kb有1个SSR 位点。其中只包含1个SSR位点的unigene 序列有6759条,其发生频率为7.72%;有1858条unigene序列含有2个及2个以上的SSR位点,发生频率为2.123%;有920条unigene序列属于混合形式的SSR标记,频率为1.051%。瓠瓜转录组中优势重复基序为单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR位点的55.51%、25.41%和17.07%。A/T、AG/CT和AAG/CTT分别是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的98.22%、55.39%和39.86%。用Primer 3.0共设计出8617对SSR引物,利用6对条带清晰、多态性稳定的SSR引物构建了36个品种的指纹图谱,部分位点具有高度的一致性,说明基因来源范围较小。聚类分析显示,在相似系数为0.68时将36个瓠瓜品种分为6类。其表明我国瓠瓜品种资源遗传多样性非常狭窄,利用现有瓠瓜资源开展品种选育潜力有限,应加强对野生特异种质的引进与发掘利用。利用瓠瓜转录组数据进行SSR标记开发,获得的SSR位点能为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。

关键词： 瓠瓜; 转录组; EST-SSR; 指纹图谱; 遗传多样性

本文引用格式

许端祥 , 杜文丽 , 陈中钐 , 赵瑞丽 , 徐同伟 , 高山 . 基于瓠瓜转录组测序的EST-SSR标记的开发及其应用[J]. 热带作物学报, 2020 , 41(3) : 529 -537 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.015

Abstract

In order to enrich the molecular marker library, the SSR markers of Lagenariasiceraria (Mol.) Stand. 87 518 unigene sequences from bottle gourd transcriptome database were developed by the MISA software. A total of 11 029 SSR loci with an occurrence frequency of 9.85% were obtained from the transcriptome of Lagenariasiceraria (Mol.), the distribution distance of the SSRs was about 1 SSR per 8.3 kb ESTs. Around 6759 unigene sequences contained a single SSR loci, and the occurrence frequency was 7.72%. Average of 1858 unigene contained 2 or more than 2 SSR loci, and the occurrence frequency was 2.123%. 920 unigene contained the mixed SSR loci, and the occurrence frequency was 1.051%. Among the SSR locis, mononucleotide, trinucleotide and dinucleotide were the major types, accounting for 55.51%, 25.41% and 17.07% of the total, respectively. A/T, AG/CT and AAG/CTT were the dominant elements among mononucleotide, dinucleotide and trinucleotide, accounting for 98.22%, 55.39% and 39.86% of the total SSRs. 8617 pairs of SSR primers were found by Primer 3.0, six primer pairs were selected and applied in PCR amplification of 36 varieties, based on the clear and repeatable polymorphism, the fingerprint of the cultivars was constructed, however, there were no differences in some loci probably due to narrow genes. The cluster analysis showed that 36 bottle gourd varieties were divided into six categories when the genetic similarity coefficient was 0.68. The results aslo showed that the genetic diversity basis of bottle gourd germplasm resources in China was very low, limiting the potential of variety development using the existing bottle gourd germplasm resources. The introduction and exploration of specific wild bottle gourd germplasm should be highly emphasized. The results indicated that SSR markers could be acquired in bottle gourd by transcriptome sequencing analysis and abundant SSR markers would provide more reliable markers for genetic diversity analysis and genetic mapping construction in bottle gourd.

Key words： bottle gourd; transcriptome; EST-SSR; fingerprint; genetic diversity

瓠瓜[Lagenaria siceraria (Mol.) Stand.]隶属于葫芦科葫芦属1年生草本植物,是世界上重要的葫芦科作物之一。瓠瓜原产于非洲南部低地,现广泛分布于非洲、印度、东南亚等地区。我国是世界上栽培瓠瓜历史最悠久的国家之一,目前广泛栽培于长江流域及以南地区,现已成为我国南方地区春、夏季重要的瓜类蔬菜作物之一,在北方地区栽培面积也日趋增大[1,2]。瓠瓜种质资源众多,但各品种间亲缘关系的鉴定和分类工作尚未形成体系,仅在形态上的划分不足以揭示瓠瓜种质资源的遗传多样性,尽管瓠瓜在生产上占有重要地位,但其遗传学基础研究却远远落后于黄瓜、西瓜、甜瓜等其他瓜类作物,目前在分子水平上检测瓠瓜不同种质间遗传多样性的研究还比较欠缺,严重阻碍了育种工作的进行。
近几年随着分子生物学技术飞速发展,作为重复性好、特异性强和多态性高的共显性遗传标记的微卫星序列即简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）分子标记早已成为植物品种鉴定、亲缘关系鉴定和遗传图谱构建等育种工作的有力手段。通过构建基因组文库、核酸数据库筛选等传统方法获得SSR引物存在的工作量大、成功率低、多态性差等诸多问题,随着第2代高通量测序技术的迅速发展,利用转录组测序的表达序列获得EST-SSR标记比基于基因组序列开发进而获得的SSR标记的方法具有更高的种间通用性,使SSR位点克隆筛选的工作效率大大提高[3]。迄今,在番茄[4]、黄瓜[5]、黄秋葵[6]等一些蔬菜作物中均已有转录组数据库成功开发出EST-SSR标记并应用于遗传多样性分析及指纹图谱构建的报道。瓠瓜的分类并没有其他主要粮食作物那样有着较明显的划分,由于人为选择和长期的引种等原因,育种工作者只是根据不同的瓠瓜种质资源的表型特性进行粗略归类,凸显了在分子水平上检测瓠瓜遗传多样性的重要性。瓠瓜的基因组序列信息和位点特异性分子标记（SSR、SNP等）长期以来少有报道,仅见王莎[1]利用SSR分子标记对瓠瓜种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行研究,因此,有必要在深度和广度上进行拓展。
本研究应用Illumina高通量测序技术获得丰富的瓠瓜转录组数据,通过搜索unigene中的SSR位点信息,分析其分布及组成特征并进行可用性评价,针对SSR位点的2侧序列开发设计了大量SSR引物,并以福州市蔬菜科学研究所种质资源库保存的具有不同优良性状的共36个瓠瓜品种进行引物的有效性验证,进而对36个瓠瓜品种进行了DNA指纹图谱的构建和亲缘关系分析,以期为瓠瓜种质鉴定、亲缘关系分析、基因的定位及分子标记辅助选择育种提供理论支撑,也为我国瓠瓜遗传改良、育种亲本选配、种质保护、核心种质库构建等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 转录组数据来源

从福州市蔬菜科学研究所瓠瓜种质资源库中选取地方特有品种福州芋瓠作为转录测序材料。于2018年4月中旬播种,5月上旬定植于福州市蔬菜科学研究所基地,于花后6 d剪去嫩叶转移至液氮速冻,-80 ℃保存备用。测序时每个单株构建1个文库,委托上海凌恩生物科技有限公司采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法构建文库进行无参转录组分析,经过滤后得到高质量的测序数据525 959 048个reads片段,共计77 337 803 108 bp（77.34 Gb）个核苷酸,采用Trinity进行序列组装产生了87 518条unigene,平均长度为1027.79 bp。76.03%的unigene长度主要集中在1~1000 bp,碱基Q20大于98%,Q30大于94%,GC含量为56.54%。该测序结果可用于后续分析。

1.2 材料来源及其DNA提取

用于SSR引物筛选和可用性评价的36个瓠瓜品种均来源于福州蔬菜科学研究所中心资源库（表1）,包括了31个国内品种及引自泰国5个品种,其均代表目前市场上栽培的主栽品种。采用CTAB法对瓠瓜基因组DNA进行提取。
表1 36个瓠瓜品种资源

Tab. 1 36 varieties of the Lagenariasiceraria (Mol.) Stand. in the study

编号Code 品种名（系）
Cultivar (Strain)		 瓜形
Fruit shape		 瓜长
Fruit length/cm		 瓜皮色
Fruit basal color		 来源地
Source
1 闽引6号 棒形 26~33 绿 中国福建
2 汉蒲1号 棒形 30~32 绿 中国湖北
3 汉蒲2号 棒形 30~34 绿白 中国湖北
4 汉蒲3号 长棒形 40~45 绿 中国湖北
5 优秀505 短棒形 24~28 绿 泰国
6 安然 短棒形 20~24 绿 泰国
7 青玉 长棒形 47~55 绿 中国湖北
8 致富 短棒形 20~25 绿 中国广东
9 碧秀 长棒形 38~47 绿 中国湖北
10 青丽 长棒形 40~50 绿 中国湖北
11 鸿尾2号 长棒形 35~49 亮绿 中国福建
12 长乐瓠瓜 棒形 25~29 绿白 中国福建
13 闽侯瓠瓜 棒形 28~34 亮绿 中国福建
14 漳平瓠瓜 棒形 25~33 绿 中国福建
15 新峰瓠瓜 棒形 24~32 绿白 中国广东
16 芽力瓠瓜 棒形 26~33 绿 中国福建
17 粤引1号 长棒形 38~44 绿 泰国
18 粤引2号 长棒形 35~40 绿 泰国
19 9089 短棒形 20~28 绿 泰国
20 佳味 短棒形 18~24 绿 中国广东
21 闽引5号 棒形 22~28 绿 中国福建
22 闽引4号 长棒形 35~40 绿 中国福建
23 闽引3号 长棒形 35~38 绿 中国福建
24 闽引2号 长棒形 34~39 绿 中国福建
25 闽引1号 棒形 25~32 绿 中国福建
26 福州芋瓠 长棒形 36~42 绿 中国福建
27 59K 长棒形 34~40 绿 中国福建
28 金铭瓠瓜 棒形 28~32 绿 中国福建
29 浙蒲2号 长棒形 34~44 绿 中国浙江
30 浙蒲6号 长棒形 34~40 绿 中国浙江
31 华瓠1号 棒形 26~32 绿 中国广东
32 青优小童子 短棒形 22~28 绿白 中国广东
33 汉蒲4号 短棒形 25~30 绿白 中国湖北
34 早棒 短棒形 25~32 绿 中国广东
35 靓丽 短棒形 24~28 绿 中国广东
36 早生瓠瓜 短棒形 23~28 绿白 中国广东

1.3 转录组SSR位点鉴别及SSR引物设计

使用MISA 程序（http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）搜索瓠瓜SSR 位点搜索,包括2、3、4、5、6核苷酸最少重复次数分别为6、5、5、4和4次为判断标准进行搜索,同时筛选复合型SSR,筛选标准为打断SSR的碱基间隔小于或等于100 bp。使用Primer 3.0软件对SSR重复单元前后的序列进行评价并分别设计3条引物。引物序列长度18~27 bp,GC含量为40%~60%,退火温度57~63 ℃,上、下游引物的Tm值相差≤2 ℃,预期扩增产物长度100~500 bp,且无2级结构和2聚体。

1.4 EST-SSR 引物筛选和指纹图谱代码构建

随机挑选并合成50对引物（华大生物科技有限公司）。PCR反应体系为20 μL,其中10 mmol/L dNTPs 0.4 μL,5 U Taq酶0.3 μL,100 ng DNA 1.5 μL,10 μmol /L的上、下游引物各1 μL,10× Buffer（Mg2+）2.5 μL,加dd H2O补至20 μL（购自大连宝生生物有限公司）。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min;37个循环,每个循环包括94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s（退火温度因不同引物而异）,72 ℃延伸1 min;最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳初筛,再用6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测,160 V电压,3 h,银染显色后观察拍照。指纹图谱代码构建方法借鉴马红勃等[7]及段艳凤等[8]的方法,对清晰、可重复的条带进行记录。按同一位点条带有无分别赋值,有带记为“1”,无带记为“0”,模板缺失记为“9”,指纹图谱的构建按照多态性条带分子量从大到小依次进行记录。

1.5 数据处理

SSR 发生频率为SSR的unigene数量与总unigene数量之比,SSR的出现频率为SSR的个数与总unigene的数量比,SSR平均分布距离为1 kb以上的unigene的碱基数与SSR数量之比。指纹图谱代码统计结果录入Excel软件,利用Power Marker软件计算PIC值,通过 NTSYSpc 2.10e 进行种质聚类分析。

2 结果与分析

2.1 瓠瓜转录组中SSR的分布及结构特点

瓠瓜转录组经测序组装共产生了87 518条unigene,平均长度为1027.79 bp。用MISA软件对1 kb以上的unigene进行检索发现8617条unigene序列中存在11 029个SSR位点,SSR位点在瓠瓜转录组中总的发生频率为9.846%,平均每8.3 Kb出现1个SSR;其中只包含1个SSR位点的unigene序列有6759条,其发生频率为7.72%,有1858条unigene序列含有2个及2个以上的SSR位点,发生频率为2.123%,有920条unigene序列属于混合形式的SSR标记,频率为1.051%。
SSR重复类型包含2核苷酸至6核苷酸重复5大类。其中3核苷酸比例最占优势,占总SSR的65.02%,其次是2核苷酸占总SSR的31.29%;4核苷酸、5核苷酸和6核苷酸重复类型数量较少,分别只占总数的2.24%、0.75%和0.70%（表2）。
表2 瓠瓜SSR的类型、数量及分布频率

Tab. 2 Type, number and frequency of SSRs in Lagenariasiceraria (Mol.) Stand.

重复基序
Repeat motif		 重复次数 Repeat number 总计
Total		 比例/% Ratio
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ≥15
2核苷酸 0 744 366 241 143 108 75 54 13 18 121 1883 31.29
3核苷酸 1521 1323 646 202 15 56 34 30 21 20 44 3912 65.02
4核苷酸 95 27 6 4 1 0 0 1 0 0 1 135 2.24
5核苷酸 34 6 3 0 0 0 0 0 1 0 1 45 0.75
6核苷酸 22 11 4 0 2 2 1 0 0 0 0 42 0.70
总计 1672 2111 659 447 161 166 110 85 35 38 167 6017
比例/% 27.79 35.08 10.95 7.43 2.68 2.76 1.83 1.41 0.58 0.63 2.78 100
瓠瓜转录组SSR重复单元的重复次数分布在5~28次之间,其中5~10次的SSR共有5582个,占总数的92.77%;其次为11~28次的SSR共有435个,占总数的7.23%。瓠瓜转录组SSR的长度集中在11~311 bp之间,其中长度在11~20 bp的SSR达6621个;占总数的65.55%,长度在20 bp以上的SSR有3488个,占34.50%。

2.2 瓠瓜转录组中SSR基序重复类型和频率特征

瓠瓜转录组SSR种类丰富,6种SSR均有出现,但出现频率不同,其中3核苷酸最多,2核苷酸次之,4核苷酸、5核苷酸、6核苷酸重复的数量较少。瓠瓜转录组中4907个SSR位点共含170种重复基序,2、3、4、5、6核苷酸重复分别有4、10、25、43和99种。从分布频率来看（表3）,以3核苷酸重复类型AAG/CTT出现最多,占总SSR的22.76%,占3核苷酸重复基序的总数的39.86%。其次是2核苷酸重复类型AG/CT,占总SSR的21.26%,占2核苷酸总数的55.39%。4核苷酸、5核苷酸尤其是6核苷酸重复基序分布较为分散,出现的次数在40以下,所占比例极低。
表3 瓠瓜转录组中不同微卫星重复基序（motif）出现的频率

Tab. 3 Occurrence frequency of different microsatellites motifs of Lagenariasiceraria (Mol.) Stand.

重复基序类型
Repeat type		 重复基序
Repeat motif		 数量 Number 发生频率/% Frequency 所占比例/% Proportion
2核苷酸 AC/GT 125 2.55 6.64
AG/CT 1043 21.26 55.39
AT/AT 552 11.25 29.31
CG/CG 163 3.32 8.66
3核苷酸 AAC/GTT 126 2.57 4.50
AAG/CTT 1117 22.76 39.86
AAT/ATT 380 7.74 13.56
ACC/GGT 92 1.87 3.28
ACG/CGT 82 1.67 2.93
ACT/AGT 22 0.45 0.79
AGC/CTG 155 3.16 5.53
AGG/CCT 149 3.04 5.32
ATC/ATG 158 3.22 5.64
CCG/CGG 521 10.62 18.59
4核苷酸 AAAC/GTTT 10 0.20 7.41
AAAG/CTTT 50 1.02 37.04
AAAT/ATTT 32 0.65 23.70
AACC/GGTT 1 0.02 0.74
其他 42 0.86 31.11
5核苷酸 AAAAC/GTTTT 1 0.02 2.22
AAAAG/CTTTT 22 0.45 48.89
AAAAT/ATTTT 3 0.06 6.67
AAATC/ATTTG 1 0.02 2.22
其他 18 0.37 40.00
6核苷酸 AAAAAG/CTTTTT 2 0.04 4.76
AAAATC/ATTTTG 1 0.02 2.38
AAAGAG/CTCTTT 3 0.06 7.14
AAATGC/ATTTGC 1 0.02 2.38
其他 35 0.71 83.33

2.3 瓠瓜转录组SSR引物设计、筛选及多态性分析

利用Primer 3.0软件对含SSR位点的8617条unigene序列进行引物设计,共设计出8088对引物。随机挑选50对不同重复单元（2、3、4、5、6核苷酸）的引物合成后对本所收集的36份瓠瓜DNA混样进行SSR-PCR扩增,以验证其有效性。根据引物设计要求,无带和条带高于750 bp的引物都不能进行后续实验,50对引物中有4对引物无带或者带不清晰,其余46对PCR扩增产物与预期大小符合,有效扩增率达到92%,说明引物设计效果基本合格。在46对有效扩增引物中经过多次试验确定最适退火温度,筛选出6对多态性引物能将36份瓠瓜品种区分开,占有效扩增率的13%;共获得86条条带,其中多态性位点为59个,多态性比率为68.6%（图1）;其中引物LsSSR25、LsSSR424和LsSSR3扩增位点数最多,分别为13、11和10个（表4）;每对引物有效多态性位点数在8~13个,每对引物平均扩增出9.8多态性位点;多态信息含量PIC值为0.299~0.839,其中YHSSR42的PIC值达到0.87,平均多态信息含量为0.513,说明选择的引物适用于试验瓠瓜样品的指纹图谱构建。
图1 引物YHSSR4（A）和YHSSR25（B）在36份瓠瓜种质资源（1~36）中的多态性

Fig. 1 Polymorphisms showed in 36 bottle gourd germplasms (1-36) by primer YHSSR4 (A) and YHSSR25 (B)

M: DNA marker.

表4 筛选的6 SSR引物信息

Tab. 4 Information of 6 SSR primer pairs

引物编号
Primer No.		 引物序列（5'-3'）
Primer sequence (5'-3')		 退火温度
Tm/℃		 多态性条带数
Number of
polymorphic bands		 多态信息含量PIC
YHSSR4 AACACCAAAAGCCACCTTGC/AAAAGTGGGCTGAGGGGTTT 58 8 0.4735
YHSSR20 AAGCAGAGCTGGGTTCAAGG/ACAGAAACTTTGGTACTCATAGTTCA 60 8 0.4191
YHSSR25 CTTACCTTCACAAAACCCCATC/ACTCTGTTTCGACTCTGCTTCC 62 13 0.3885
LsSSR34 AACTGAAACCATTAACGAAGGC/AATAAGCAGCAACCATGTCAAC 60 10 0.2995
YHSSR42 CAATAGAGTAGGGTGGGGCATA/TAAAATAGTGGGAGAGCAAGGG 60 11 0.8390
YHSSR46 CTCTCTATATGTCTAATTCCTCGCC/CAAATTCACAGTTGTTGTCACG 60 9 0.6618

2.4 DNA数字指纹图谱构建

根据筛选的6对SSR引物在36个瓠瓜品种的扩增结果,构建出36个品种资源的DNA数字指纹图谱（表5）,可见部分位点在多数品种中呈现较高的一致性,说明36份瓠瓜的基因来源范围较窄。但36个品种的DNA指纹图谱均独一无二,因此可用于瓠瓜品种资源的分类与鉴定。
表5 36份瓠瓜品种资源分子指纹图谱

Tab. 5 Fingerprinting for 36 Lagenariasiceraria (Mol.) Stand. varieties

编号Code SSR4 SSR20 LSRO15 LSRO47 LSR108 LSR112
1 10001101 01100011 0010110100100 0000101110 10000000110 001100110
2 10001101 01100011 0010110100100 0000101110 10000000010 000000100
3 00001101 01100011 0010110100100 0000101110 11000000010 001100110
4 11011010 01100011 0011000110101 0110101110 10000001010 000000100
5 10001101 01100011 0010110100100 0001010110 00000011011 001000100
6 10001101 01100011 0011000110101 0000101011 00011000010 000000100
7 10001101 01100011 0010110100100 0000101011 11100110010 001100110
8 10001101 01100011 0010110100100 0000101011 10000110010 001100110
9 10001101 01100011 0010110100100 0000101011 01111101100 000000100
10 10001101 01100011 0010110100100 1000101011 11011101010 001100100
11 10001101 11101110 0001001010110 0001010110 11101101010 000000010
12 10001101 01101110 0001001111011 0001010110 11110001001 001010100
13 10001101 01100011 0001001010010 0001010110 00001001001 000000100
14 10001101 01100011 0001000101011 0001010110 00000000011 001000100
15 10001101 01100011 0001001010010 0001010110 00000001101 000000100
16 10001101 01100011 0010110100100 0001010110 00001001001 000000110
17 10001101 00010011 0010111110110 0001010110 10101101010 000000010
18 10001101 00010011 0000000011011 0001010110 00001000010 000110100
19 10001101 00010011 0000110100100 0000101011 10001001010 000110100
20 10001101 00010011 0000110100100 0000101011 10000001010 000000100
21 10001101 00010011 0000110100100 0000101011 10101100001 010000100
22 11011010 00010011 0001001111011 0000101011 11111101010 010000101
23 10001101 00010011 0010110100100 0000101011 11111101010 000111000
24 11111011 00010011 1110010110101 0000101011 11101000010 000000100
25 00001101 00010011 0010110100100 0000101011 11000000010 000111000
26 11011010 00110011 0011000110101 0000101011 11101101001 000111000
27 11011010 00010011 0010110100100 0000101011 11111101101 001011100
28 10001101 00010011 0010110100100 1000101111 11101001110 000000100
29 10001101 00110101 0010110100100 0000101011 11001001010 100000101
30 00001101 01100011 0010110100100 0110000110 01000001001 011000111
31 10001101 01100011 0010111110110 1000101011 11000100011 011010101
32 00000011 01100011 0001000110010 1000101011 00000001010 000000100
33 10001101 01100011 0010110100100 1000101011 11011000101 000001000
34 10001101 01100011 0000000011011 1001010110 00000000010 000000100
35 9 01100011 0001001010010 0001010110 9 000000100
36 11111111 01100011 1000011010010 0110000110 10110001101 000000100

2.5 利用SSR标记对瓠瓜品种资源聚类分析

根据6对引物扩增的59个多态性位点,对36份瓠瓜供试品种资源进行了聚类分析,其遗传相似系数变幅为0.60~0.97。在遗传距离0.60处,36份瓠瓜划分成2大类,在遗传距离0.68处划分为6类（图2）：第1类包含有19份瓠瓜品种资源,按瓜皮色种质区分,除2份白绿色外其余均为绿色;其中长棒形的有6份,棒形的有8份,短棒形的有5份;6份来自中国福建,6份来自中国湖北,3份来自中国广东,2份来自中国浙江,还有2份来自泰国。第2类有来源于中国湖北、中国广东和泰国的3份瓠瓜品种资源;其中长棒形1份,短棒形2份;2份绿瓜皮色,1份绿白皮色。第3类有4份瓠瓜种质,瓜型、瓜皮色一致,且品种资源均来自中国福建。第4类包含来自福建和泰国2份瓠瓜品种资源,瓜型均为长棒形,瓜皮色分别为亮绿和绿色。第5类包含7份瓠瓜品种资源,其中长棒形1份,棒形4份,短棒形2份;4份瓜皮绿色,2份瓜皮绿白色,1份瓜皮亮绿色;来自福建和广东的各有3份,1份来自泰国。来自广东的瓜形短棒形、瓜皮色为绿白的瓠瓜被单独列为一类。
图2 基于SSR分子标记的36个瓠瓜品种资源的聚类分析图

Fig. 2 Cluster dendrogram of 36 bottle gourd varieties based on SSR markers

3 讨论

本研究基于瓠瓜转录组获得87 518条unigene序列进行SSR位点搜寻,共检测出11 029个SSR位点,总发生频率为9.85%,分布距离为平均每8.3 kb有1个SSR位点,此结果略高于大王杜鹃（9.32%）[9]、花楸（6.86%）[10]、芒果（7.57%）[11]、枇杷（8.55%）[12]等的频率范围,但显著低于萝卜（20.37%）[13]、桃（20.76%）[14]和黄秋葵（20.59%）[6]的位点频率,表明不同物种中转录组的SSR发生频率并没有特定的规律,在进化过程中不同的经历都有可能影响SSR的位点发生频率,同时受转录组SSR挖掘工具及筛选的条件影响[15]。但从总体上看瓠瓜转录组中SSR数量较丰富。
SSR重复类型也是转录组的重要特征之一。瓠瓜SSR重复类型,包含2核苷酸至6核苷酸重复5大类,其中3核苷酸比例最占优势,占总SSR的65.02%;其次是2核苷酸占总SSR的31.29%;4核苷酸、5核苷酸和6核苷酸重复类型数量较少,分别占总数的2.24%、0.75%和0.70%。其与杜鹃[16]、菜薹[17]、黄秋葵[6]等作物的研究结果不尽相同,猜测原因是由于2、4和5核苷酸重复主要与非翻译区（UTR）相关。而3、6核苷酸重复主要发生在编码序列（CDS）内[18],瓠瓜中3核苷酸重复比例最高,说明其转录组unigene中可能包含更多的CDS信息。进一步对重复基序进行分析,发现以3核苷酸重复类型AAG/CTT出现最多,占总SSR的22.76%;其次是2核苷酸重复类型AG/CT,占总SSR的21.26%。这与黄瓜[19]、蓖麻[20]、芝麻[21]、黄秋葵[6]等双子叶植物现象相类似,高比例AAG/CTT和AG/CT基序的出现可能是双子叶植物SSR的特征之一。
转录组测序的出现,使得EST数量迅速增加,许多植物中EST-SSR标记已被开发应用[22],但瓠瓜EST-SSR标记鲜少报道。本研究利用基于瓠瓜转录组数据开发的SSR引物,筛选出6对多态性引物将36份瓠瓜品种资源区分开来,多态性比率为68.6%。多态性信息含量（PIC）是衡量引物多态性信息含量水平的重要指标（高：PIC>0.5、适中：0.25<PIC<0.5、低：PIC<0.25）[23]。试验所选的6对多态性引物的PIC平均值大于0.5,说明所选引物适用于36份瓠瓜品种资源进行指纹图谱的构建。6对SSR引物在36份供试瓠瓜品种资源上获得的多态信息,构建了供试36份瓠瓜品种资源唯一的DNA指纹图谱,可将36份瓠瓜品种资源有效区分开来。
根据6对引物扩增的59个多态性位点,为36份供试瓠瓜品种资源进行了聚类分析,其遗传相似系数变幅为0.60~0.97。在遗传相似系数为0.60处36份瓠瓜品种资源可分为2个类群。在遗传相似系数为0.68处可分为6类：第1类包含有19份品种资源,来源地主要集中在福建和湖北,还有2份来自泰国;瓜皮色绿色的占89%,说明此类可以通过地域和果皮颜色不同来区分。第2类包含来源于湖北、广东和泰国3份品种资源。第3类包含4份瓠瓜品种资源,瓜型均为长棒形,瓜皮色绿色,且种质资源均来自福建。第4类包含2份瓠瓜品种资源,来自福建和泰国,瓜型均为长棒形,瓜皮色分别为亮绿和绿色。第5类包含7份瓠瓜品种资源,其中来自福建和广东的各有3份。第6类为来自广东的短棒形、绿白瓜皮色的瓠瓜品种资源。通过聚类分析的结果表明,利用筛选得到的6对SSR引物可将36份瓠瓜品种资源中的大部分区分开,36份瓠瓜品种资源的聚类结果与种源地、瓜型和瓜皮色有很大的相关性。而王莎[1]利用14个SSR标记对44份瓠瓜品种的多样性进行分析,表明相同瓜型的品种有聚集在一起的趋势,不同品种资源的来源地分类却不明显。虽然本研究中仍有部分瓠瓜品种资源未能区分,其可能原因与市场上主栽瓠瓜品种间亲缘关系近、不同地域之间的瓠瓜相互引种及同种异名等有关,且在瓠瓜的瓜皮色判断上因栽培方式、人为因素等原因也容易出现混淆。
本研究结果表明,利用瓠瓜转录组数据开发出的SSR标记具有可行性,为瓠瓜品种资源遗传图谱构建、基因定位、克隆等育种工作奠定了基础。现有瓠瓜核心品种资源间亲缘关系近,在今后的育种工作中应加大国外品种资源或野生种质的引进,发掘更多的瓠瓜优异资源提高遗传多样性。

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