甘蔗宿根矮化病（ratoon stuning disease, RSD）是世界甘蔗主要的病害之一,由1种寄居木质部的棒状杆菌属细菌Leifsonia xyli subsp. Xyli（Lxx）引起,病原细菌大小为(0.25~0.50) μm× (1.00~4.00) μm[1]。Lxx难以分离培养,直到1980年,Davis等[2]才成功获得纯培养的细菌。甘蔗感染RSD后,主要表现为植株矮化、蔗茎变细、分蘖减少等症状,且随宿根年限增加而加重。Ward[3]研究发现,Q138、Q122新植蔗比对照减产19%和22%,第1年宿根分别减产30%和40%。Grisham[4]研究发现,第1年新植蔗减产14%,到第3年减产27%。RSD主要通过收获机械和带病蔗种传播[5],虽然生产上用50 ℃水处理2 h,对病菌有一定的抑制作用,但并不能完全去除[6,7]。由于感染病害的甘蔗外部和内部均无明显的病症,单从外观难以鉴定,虽然目前利用PCR技术对Lxx病原菌进行检测的方法非常成熟[6, 8-10],但对操作人员以及设备要求较高,在应用于生产和大批量检测中存在很大困难,使得病害蔓延。本研究主要以感染RSD病菌后的‘Badila’和健康的‘Badila’甘蔗为研究材料,应用定量PCR和组织切片技术,揭示RSD病原菌侵染后,菌量在蔗茎中的分布情况与茎维管束的病变规律,为进一步研究Lxx与甘蔗寄主的互作关系提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选择RSD易感甘蔗品种‘Badila’,利用Lxx-PCR检测[8]蔗茎确认不带病后砍成双芽段,进行温汤处理2 h。利用本实验室分离培养的Lxx菌液接种蔗茎剖面,28 ℃培养6 h,于2017年2月种于福建省亚热带植物研究所,共种植50株,并于2017年12月对接种甘蔗进行Lxx病原菌检测。
1.2 方法
1.2.1 感病蔗茎中Lxx病原菌DNA提取 按图1所示取蔗茎不同部位,蔗茎在流水中冲洗5 min,去皮,将蔗茎切成约1 cm×1 cm×3 cm大小。用钳子榨取蔗汁于2 mL离心管中并立即放入冰盒中,以减少蔗汁褐变,3000 r/min离心2 min,取上清,5000 r/min离心1 min后弃上清,用PBS缓冲液重悬浮。参照TIANamp Bacteria DNA Kit 细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书进行操作。
1.2.2 荧光定量PCR对蔗茎中Lxx绝对定量 参照Carvalho等[6]的方法进行Lxx细胞数的定量。荧光定量标准曲线样品的制备：对Lxx菌基因组进行稀释,先用超微量分光光度计测定Lxx基因组的质量和浓度,稀释到约10 ng/μL（每次稀释后,初始浓度略有差异）,作为Lxx基因组梯度稀释母液,按10倍浓度梯度稀释5个梯度。待测DNA样品用超微量分光光度计测定其浓度并做记录,每个样品取2 μL用于定量分析。荧光定量的引物见表1,PCR体系为：10 μL SYBR Premix ExTaq II（Tli RNaseH Plus）（2×）,0.8 μL正向引物Lxx12950 F1,0.8 μL反向引物Lxx 12950 R1,0.4 μL ROX Reference Dye II（50×）,2 μL DNA模板,ddH2O 6 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火延伸30 s,40个循环。将样品在ABI 7500上扩增,每个样品技术重复3次,以无菌水为模板的体系作对照,根据标准曲线算出每个样品的Quantity Mean,DM=Quantity Mean/Concentration of Leaf Genome (ng/μL),2.63×10-6 ng为每个Lxx细胞中基因组质量（来自Lxx CTCB07,GenBank：AE016822.1）,根据公式NC=DM/2.63×10-6来评估Lxx细胞个数,NC,即为甘蔗叶片中Lxx滴度。获得的病原菌含量数据采用SPSS统计软件进行方差分析。
表1 RSD PCR检测引物Tab. 1 RSD PCR primer sequence |
| 名称Name | 引物序列Primer sequence（5'—3'） | 长度Length/bp | 引物来源Origin | 产物Product/bp |
|---|---|---|---|---|
| Lxx12950F1 | GCACATCGATCTGGAAAAAAGG | 22 | 基因“Lxx12950” | 106 |
| Lxx12950R1 | GGATTCGGTTCTCATCTCAGC | 21 |
1.2.3 树脂半薄切片的制作 对PCR检测成阳性的样品取样,取蔗茎芽部、近带蔗皮处、茎中央、茎节、茎间中央各部位组织,具体如图2所示。
（1）前固定：将不同组织部位材料,用刀片切成截面1 mm×1 mm,长3 mm大小,置于0.2 mL离心管中,做好标记,加入已配置好的2.5% 戊二醛溶液,抽真空赶走气泡,使固定液和组织充分接触,置于4 ℃,3 h。
（2）洗涤：倒掉固定液,用0.1 mol/L,pH为7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次,每次30 min。
（3）后固定：用1% 的锇酸溶液固定4 ℃过夜。
（4）洗涤：液洗涤3次,每次30 min。
（5）丙酮脱水：10%~90% 丙酮逐级脱水,每级20 min,100% 丙酮脱水3次,每次30 min（整个过程在摇床上进行）。
（6）包埋：树脂配方参照EMbed 812 Kit说明书（Mixing Instruction）,丙酮:不完全树脂= 3:1,2 h;丙酮:不完全树脂=1:3,4 h;不完全树脂,过夜（干燥器内不加盖过夜）;完全树脂,48 h（中间换新鲜完全树脂1次）;包埋,先于干燥器中放置 12 h,后将其摆正,最后于70 ℃烘箱中1~2 d.
（7）半薄切片：在制刀机上制备好玻璃刀,于超薄切片机上对修好的包埋块样品切成1 μm的半薄切片。
（8）镜检观察：1% 甲苯胺蓝染色,显微镜镜检观察。
2 结果与分析
2.1 Lxx病原菌在蔗茎中的分布情况
感染RSD的‘Badila’蔗株茎部由基层到尾层,Lxx菌量呈现递减趋势,甘蔗基部茎节处Lxx含菌量最高,基部茎间相对茎节Lxx菌含量下降了44.89%,中间茎间相对茎节含量下降了49.26%,而顶端茎间相对茎节下降18.46%,但经统计学分析各部位的菌量差异未达到显著水平。
2.2 感染Lxx病原菌对蔗茎局部结构的影响
对健康蔗株和RSD蔗株根带芽处进行横向切片发现（图4）,RSD芽轴、芽原基染色较深（图4A1,图4a1）。通过对茎部根带、茎间的维管组织切片发现,健康蔗株维管组织结构相较于RSD蔗株完好,主要差异体现在韧皮部和近导管处（图4A2,图4a2）,此外茎节处的异形木质部内染色较重,存在不明内容物（图4a2）。对茎基部、中部、顶部3层维管组织进行的切片镜检结果显示,RSD蔗株基部和中部的维管组织结构破损严重,中间的原形成层细胞散裂明显（图4a3,图4a4）,顶端蔗茎维管组织结构完好清晰（图4a3,图4a4,图4a5）,健康蔗株与RSD蔗株一样,基部维管组织染色较深,但基部、中部、顶部维管组织,结构完好,差异不大（图4A3,图4A4,图4A5）。
图4 感染RSD的蔗茎局部组织结构（400×）A1~5为健康蔗株茎部局部结构,a1~5为RSD蔗株茎部局部结构。A1、a1为茎节芽部,A2、a2为茎节处维管组织,A3~5、a3~5 分别为健康/RSD 蔗株基部（3）、中部（4）、顶部（5）维管组织。Xy：木质部;Ph：韧皮部;Bp：芽原基;Ste：芽轴。 Fig. 4 Local tissue structure of sugarcane infected with RSD (400×) A1-5 is a local structure of the stem of healthy sugarcane, and a1-5 is a part of the stem of the sugarcane infected RSD. A1, a1 are stem node bud. A2, a2 are vascular tissue at stem node. A3-5, a3-5 are healthy/RSD infected sugarcane base (3), middle (4), apical (5). Xy: xylem; Ph: phloem; Bp: bud primordium; Ste: protocambium. |
从茎节和茎间的局部纵切面的维管组织切片发现（图5）,无论是健康的还是感病的甘蔗茎节的基本细胞相较于茎间的小得多,且具有木质部异形、细胞大小不一、细胞整体较为密集的情况,推测茎节的组织结构在一定程度上阻碍了病原菌的向上运输。
图5 甘蔗茎局部组织纵切面结构图（400×）H1、H2、H3分别为染RSD蔗株茎基部茎节中央处、茎顶部茎节中央处、茎节间中央处局部纵切面;J1、J2、J3分别为健康蔗株茎基部茎节中央处、茎顶部茎节中央处、茎节间中央处局部纵切面。 Fig. 5 Structure of longitudinal section of local tissue of sugarcane stem (400×) H1, H2 and H3 are local longitudinal plane of basal stem node, tail stem node, stem internode that infected RSD; J1, J2 and J3 are local longitudinal plane of basal stem node, tail stem node, stem Internode of healthy sugarcane. |
3 讨论
甘蔗茎为实心,可分为表皮、皮层、基本组织、维管束4个部分。表皮外被有明显的角质层,下皮层以内是不同程度加厚的皮层细胞,维管束贯穿于基本组织中,分散于整个切面内,靠边缘的维管束和靠中央的维管束在鞘细胞的排列方式上是不同的。靠边缘的维管束导管口径较小,但维管束鞘较发达,向心加厚;靠中央的维管束导管口径较大,维管束鞘不如边缘维管束明显,成典型帽状分布,即在韧皮部和木质部均有厚壁细胞。基本组织由薄壁细胞组成,分布于皮层内部维管束之间,维管束相互连接构成维管系统,主要作用是为植物体输导水分、无机盐和有机养料等,也有支持植物体的作用。胡敏[11]通过原位PCR方法对感染RSD的甘蔗Lxx的定位分析发现,在蔗茎维管组织中,Lxx主要分布在维管组织的木质部导管、韧皮部处,尤其是木质部与韧皮部之间的原形成层处。本研究RSD蔗株茎样品半薄切片呈现出木质部、韧皮部细胞形状异形且细胞散裂,原形成层细胞也存在散裂明的现象。此外茎节处的异形木质部内染色较重,存在不明内容物,这与Giliaspie等[12]和陈明辉等[13]研究结果一致,推测是Lxx菌表面的病原相关分子如多糖或鞭毛蛋白等刺激诱导产生非特异防御或者是植物R蛋白识别病原微生物后所产生特异性防御所产生的分泌物质。其不明内容物影响了筛分子对糖（蔗糖为主）、蛋白质、脂肪、氨基酸、酰氨、维生素、无机盐和植物激素的运输,从而导致染病的蔗株变矮,蔗茎变细,生长迟滞。
过去的研究发现,Lxx侵染甘蔗后主要集中在其甘蔗茎基部2~3节间处[14]。本研究发现,Lxx菌量随蔗茎生长从下往上逐层减少,这与对茎基部、中部、顶部3层维管组织进行的切片镜检结果中维管组织的完整性存在一定的关联性,感染RSD蔗株基部维管组织结构破损严重,顶端蔗茎维管组织结构完好清晰。横向切片的结果表明,甘蔗茎节的基本细胞相较于茎间的小得多,且具有木质部异形、细胞大小不一、细胞整体较为密集的情况。根据q-PCR对RSD蔗株茎部病原菌Lxx的富集量分析发现,茎间蔗汁中Lxx的菌量少于茎节处,推测茎节与茎间的结构差异可能是Lxx定植差异导致的,其体现病原菌与寄主互作过程中,病原菌Lxx对定植微生态的自主选择。
4 结论
感染RSD的蔗茎维管组织中的韧皮部和木质部的损坏程度与Lxx菌量分布呈正相关。甘蔗茎节与茎间的组织结构差异是Lxx菌量由基层到尾层呈现递减的原因之一,以上结果为今后进一步研究Lxx与甘蔗寄主的互作提供了一定的理论依据。