辣木（Moringa oleifera Lam.）为辣木科辣木属热带落叶乔木,原产于北印度喜马拉雅区域及非洲,目前已在我国广东、福建等省大面积种植。辣木含有氨基酸、矿质元素、微量元素等多种营养物质,被誉为“生命之树”;辣木也是治疗糖尿病、高血压、皮肤病、贫血症、关节炎、肿瘤等疾病的传统药材[1,2,3,4]。近年来,人们对辣木营养成分和药用成分的研究越来越系统和广泛,发现辣木不同部位均含有生物活性成分[5,6,7],其中辣木多糖为辣木提取物中的重要有效成分之一[8],具有清除自由基、抗丙肝病毒等多种活性[9,10],有很高的利用价值。
植物多糖是植物体内普遍存在的一大类生物大分子,有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种重要的生物活性,是天然药物的常见来源[10]。植物多糖的提取工艺仍是研究热点,常见的提取方法有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶促法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等。其中,酶技术是近年来广泛应用的一项生物技术,在多糖提取过程中,使用酶可降低提取条件,在比较温和的条件下分解植物组织,还可分解提取液中的淀粉、果胶、蛋白质等物质,提高提取效率。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等。酶解法的优势越来越受到研究人员的关注,有众多关于酶在多种植物多糖提取中应用的报道[11],而在辣木多糖的提取研究中[12,13,14]未见酶促法提取的报道。本研究选择纤维素酶,采用酶促法和二次回归正交旋转组合设计对辣木中多糖的提取工艺进行优化,建立回归模型,探讨最佳提取条件;在此基础上研究辣木植株不同部位多糖的含量,以期为辣木多糖的有效提取利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 辣木的根、茎、叶、花于2016年5月17日采自福建省农业科学院果树研究所辣木试验基地（北纬26°7′47″,东经119°19′59″）,种子于2015年12月10日采于该基地,经电热恒温鼓风干燥机80 ℃烘干,粉碎后过80目筛,收集筛下物密封保存备用。
1.1.2 主要试剂 纤维素酶：Solarbio,北京索莱宝科技有限公司,货号：C8270,酶活：3 U/mg;无水葡萄糖、硫酸、蒽酮等均为分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器 TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司;FW100高速万能粉碎机：苏州江东精密仪器有限公司;FA2004电子分析天平：上海恒平科学仪器有限公司;UNIQUE-S15超纯水机：锐思捷科学仪器有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵：上海亚荣生化仪器厂;PCD-C3000电热恒温鼓风干燥机：上海龙跃仪器设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 多糖标准曲线的绘制 多糖的测定以无水葡萄糖为标准品,采用蒽酮-硫酸比色法[15]。准确称取无水葡萄糖（已于120 ℃烘箱中烘1 h,取出放干燥器冷却备用）标准品25 mg,精密称定,置250 mL量瓶中,加反渗透水适量溶解,稀释至刻度,摇匀,即得（每 l mL中含无水葡萄糖0.1 mg）。标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,分别置具塞试管中,分别加水补至2.0 mL,精密加入硫酸蒽酮溶液（称取蒽酮0.1 g,加浓硫酸100 mL溶解,摇匀）8 mL,摇匀,置沸水浴中加热15 min,取出,迅速冷却,以相应的试剂为空白对照,625 nm波长处测定吸光度。得溶液中无水葡萄糖浓度C（mg/mL）与其吸光度A的回归方程为：C = 0.329×A-0.055,相关系数r=0.997,说明该检测方法中,葡萄糖溶液浓度与吸光度有良好的线性关系。
1.2.2 多糖的提取 多糖的提取参照梁鹏等[9]的方法并略加修改。精确称取干燥的辣木根粉末0.5000 g于三角瓶中,提取液为pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,水浴摇床（100 r/min）,浸提1次。根据考察的因素改变相应的试验参数,提取后趁热抽滤,用少量提取液洗涤滤器,合并滤液与洗液,放冷,移至500 mL量瓶中,用提取液稀释至刻度,摇匀,备用。
1.2.3 多糖的测定 多糖的测定采用蒽酮-硫酸比色法[15]。精确量取样品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中,以试剂空白为参比,按蒽酮-硫酸比色法测定其在625 nm处的吸光度。根据标准曲线计算所测样品溶液的质量浓度,并计算辣木根粉中多糖的提取率或含量：
\[多糖提取率含量= \frac {C×n×V}{v×m×1000}×{100} (1) \]
式中,C为多糖溶液浓度（mg/mL）,n为稀释倍数,V为溶液体积（mL）,v为测定溶液体积（mL）,m为辣木样品用量（g）。
1.2.4 实验设计 采用单因素试验分别单独考察纤维素酶用量（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、
2.0%、2.4%,以辣木根粉用量为标准计算）、提取温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、提取时间（30、60、90、120、150 min）、液料比（10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1,mL∶g）、提取次数（1、2、3次）对辣木多糖提取率的影响。
表1 二次回归正交旋转组合设计的因素水平编码Tab. 1 Factor levels of quadratic regression rotational combinational design |
| 因素 Factor | 零水平 Zero level | 变化半径 Radius of change | 编码x设计水平 Coding design level of x | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | |||
| 纤维素酶用量 Enzymatic dosage/% | 1.2 | 0.6 | 0 | 0.6 | 1.2 | 1.8 | 2.4 |
| 提取温度 Extraction temperature/℃ | 45 | 12.5 | 20 | 32.5 | 45 | 57.5 | 70 |
| 提取时间 Extraction time/min | 90 | 30 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 |
| 液料比 Ratio of liquid to material/(mL·g-1) | 45∶1 | 12.5∶1 | 20∶1 | 32.5∶1 | 45∶1 | 57.5∶1 | 70∶1 |
1.3 数据处理
采用SPSS 13.0软件对结果进行多元回归拟合分析,并采用Duncan’s新复极差检验进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 纤维素酶用量对辣木多糖提取率的影响 在提取温度50 ℃、提取时间90 min、液料比40∶1时,分别测定纤维素酶用量在0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%条件下的辣木多糖提取率。由图1可知,使用纤维素酶能显著提高辣木多糖的提取率,且随着纤维素酶用量增大,提取率随之增加。纤维素酶用量<1.2%时,提取率增加缓慢;酶用量从1.2%提高到2.0%时,提取率增加迅速;当酶用量>2.0%后,增加酶用量虽能提高提取率,但趋势趋于平缓。因此,从节约成本的角度考虑,选择纤维素酶用量为2.0%为最佳比例,在此条件下,多糖的提取率为19.24%,比未使用酶时提高45.21%。
2.1.2 提取温度对辣木多糖提取率的影响 在纤维素酶用量为2.0%、提取时间90 min、液料比40∶1时,分别测定提取温度25、30、40、50、60、70 ℃条件下的辣木多糖提取率。由图2可知,当温度从25 ℃升高到50 ℃,多糖提取率缓慢增加,但增幅较小;当提取温度从50 ℃提高到60 ℃,多糖提取率直线上升,提取率达19.04%,比25 ℃时提高33.24%,效果显著;温度继续升高多糖提取率反而下降,主要原因一是温度过高可能引起多糖降解或转化,二是温度过高会使纤维素酶失活（最适温度为45~65 ℃,pH 4.5~6.5）,反而起不到促进提取的作用。因此,选择60 ℃为最佳提取温度。
2.1.3 提取时间对辣木多糖提取率的影响 在纤维素酶用量为2.0%、提取温度60 ℃、液料比40∶1时,分别测定提取时间30、60、90、120、150 min条件下的辣木多糖提取率。如图3所示,随着提取时间延长,多糖提取率呈先升高后降低的趋势,其中以提取时间为90 min时提取率最高,可达19.74%,故选择90 min为最佳提取时间。
2.1.4 液料比对辣木多糖提取率的影响 在纤维素酶用量为2.0%、提取温度60 ℃、提取时间90 min时,分别测定液料比（mL∶g）为10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1条件下的辣木多糖提取率。如图4所示,以液料比20∶1时提取率最高,为19.34%;在相同物料时,随着提取液体积增大,多糖提取率反而下降。
2.1.5 提取次数对辣木多糖提取率的影响 在纤维素酶用量为2.0%、提取温度60 ℃、提取时间90 min、液料比20∶1时,重复提取3次,每次提取后分别定容并测定多糖提取率。从图5可以看出,第一次酶解浸提提取率为19.34%,第二次酶解浸提提取率仅为3.71%,即第一次酶解浸提即可实现84.49%的多糖浸出,故研究中为了节约成本和提高效率,选择1次酶解浸提即可。
2.2 二次回归正交试验
表2 二次回归正交旋转组合设计试验及结果Tab. 2 Result on quadratic regression rotational combinational design |
| 序号 Index | X1：纤维素酶用量 Cellulose dosage/% | X2：提取温度 Extraction temperature/℃ | X3：提取时间 Extraction time/min | X4：液料比 Solid-liquid ratio/(mL·g-1) | Y：多糖提取率 Extraction rate of polysaccharide/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 18.1378 |
| 2 | 1 | -1 | -1 | -1 | 19.3378 |
| 3 | 1 | 1 | -1 | -1 | 16.6118 |
| 4 | 1 | -1 | 1 | -1 | 17.5824 |
| 5 | 1 | 1 | 1 | -1 | 17.6698 |
| 6 | 1 | -1 | -1 | 1 | 16.9362 |
| 7 | 1 | 1 | -1 | 1 | 18.7830 |
| 8 | 1 | -1 | 1 | 1 | 18.6167 |
| 9 | 1 | 1 | 1 | 1 | 16.4039 |
| 10 | 0 | -2 | 0 | 0 | 16.2564 |
| 11 | 0 | 2 | 0 | 0 | 19.5712 |
| 12 | 0 | 0 | -2 | 0 | 16.5568 |
| 13 | 0 | 0 | 2 | 0 | 19.2487 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | -2 | 18.4328 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18.8880 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 0 | 17.4831 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 19.9078 |
| 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18.4948 |
| 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 15.0969 |
| 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18.0712 |
| 21 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18.8880 |
| 22 | -1 | -1 | -1 | -1 | 16.0877 |
| 23 | -1 | 1 | -1 | -1 | 15.4059 |
| 24 | -1 | -1 | 1 | -1 | 17.2654 |
| 25 | -1 | 1 | 1 | -1 | 18.1753 |
| 26 | -1 | -1 | -1 | 1 | 14.2943 |
| 27 | -1 | 1 | -1 | 1 | 15.7726 |
| 28 | -1 | -1 | 1 | 1 | 16.8813 |
| 29 | -1 | 1 | 1 | 1 | 16.0271 |
| 30 | -2 | 0 | 0 | 0 | 14.3930 |
表3 辣木多糖酶促提取工艺回归正交试验方差分析结果Tab. 3 Variance analysis of regression orthogonal experiment results of polysaccharide extraction |
| 变异源 Source of variance | 平方和 Sum of squares | 自由度 df | 均方 Mean square | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| X1 | 15.8789 | 1 | 15.8789 | 16.6421 | 0.0010** |
| X2 | 13.7596 | 1 | 13.7596 | 14.4209 | 0.0018** |
| X3 | 4.4627 | 1 | 4.4627 | 4.6772 | 0.0471* |
| X4 | 11.4559 | 1 | 11.4559 | 12.0065 | 0.0035** |
| X1X2 | 0.4735 | 1 | 0.4735 | 0.4963 | 0.4919 |
| X1X3 | 0.1049 | 1 | 0.1049 | 0.1100 | 0.7448 |
| X1X4 | 0.0004 | 1 | 0.0004 | 0.0005 | 0.9830 |
| X2X3 | 0.1851 | 1 | 0.1851 | 0.1940 | 0.6659 |
| X2X4 | 0.1288 | 1 | 0.1288 | 0.1350 | 0.7184 |
| X3X4 | 0.0374 | 1 | 0.0374 | 0.0392 | 0.8458 |
| X12 | 7.3620 | 1 | 7.3620 | 7.7159 | 0.0141* |
| X22 | 6.6798 | 1 | 6.6798 | 7.0009 | 0.0183* |
| X32 | 1.0046 | 1 | 1.0046 | 1.0529 | 0.3211 |
| X42 | 10.8077 | 1 | 10.8077 | 11.3271 | 0.0042** |
| 回归模型Model | 65.9261 | 14 | 4.7090 | 4.9353 | 0.0020** |
| 残差项Residual | 14.3121 | 15 | 0.9541 | ||
| 失拟项Lack of fit | 10.1142 | 10 | 1.0114 | 1.2047 | 0.4435 |
| 误差项Pure error | 4.1979 | 5 | 0.8396 | ||
| 总和Total | 80.2382 | 29 |
Note: * represents significant difference (p<0.05); ** represents extremely significant difference (p<0.01). | |
注：*表示差异显著（p<0.05）,**表示差异极显著（p<0.01）。 |
2.2.1 回归方程的建立 运用SPSS 13.0软件对数据（表2）进行统计分析,得到纤维素酶用量（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）、料液比（X4）4个因素与辣木多糖提取率（Y）之间的二次正交回归方程为：
Y=18.6602+0.8134X1+0.7572X2-0.4312X3+0.6909X4-0.1720X1X2+0.0810X1X3+0.0053X1X4+0.1076X2X3+0.0897X2X4+0.0483X3X4-0.5181X12-0.4935X22-0.1914X32-0.6277X42。
由方差分析结果可知,模型中X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4及X32项对提取率的影响均不显著（p>0.05）。由于试验设计的正交性,各回归系数间无相关性,因此可根据方差分析结果,直接剔除模型中的不显著项建立回归方程。简化的二次正交回归方程为：
Y=18.6602+0.8134X1+0.7572X2-0.4312X3+0.6909X4- 0.5181X12-0.4935X22-0.6277X42。
2.2.2 回归模型的显著性检验 按照显著性条件对回归方程进行可靠性检验。由表3可知,回归模型F=4.9353,p<0.01,表明该模型具有统计学意义,可以建立回归方程;失拟项F=1.2043,p>0.05,失拟项不显著,说明回归模型与实际情况拟合好,无失拟因素存在,可用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。
2.2.3 主效应分析 显著性检验的p值可反映各试验因素对试验指标影响程度的大小,p值越小表明该因素对试验结果的影响越大。由表3可知,4个试验因素对辣木多糖提取率的影响顺序为：纤维素酶用量（X1）>提取温度（X2）>料液比（X4）>提取时间（X3）。
2.2.4 单效应分析 用降维法将任意3个因素固定在零水平,得到第4个因素与辣木多糖提取率
的效应方程分别为：
Y1=18.6602+0.8134X1- 0.5181X12
Y2=18.6602+ 0.7572X2-0.4935X22
Y3=18.6602-0.4312X3- 0.1914X32
Y4=18.6602+0.6909X4-0.6277X42
以辣木多糖提取率与各因素水平作图,由图6可知,4个因素与辣木多糖提取率的关系均为开口向下的抛物线关系,说明这4个因素对提取率的影响均存在一个合理的范围,即对多糖提取率的影响均呈先上升后下降的变化趋势。这均与单因素试验结果相吻合。纤维素酶用量、提取温度、料液比的变化趋势接近,但纤维素酶用量、提取温度的斜率更大,说明其作用更大,随着纤维素酶用量增加或提取温度增加,多糖提取率不断增加。
2.3 辣木多糖提取最优方案及验证
通过回归模型预测的酶促提取辣木多糖的最优提取工艺为：纤维素酶用量1.57%、提取温度52.96 ℃、提取时间67.69 min、液料比（mL∶g）52.09∶1,考虑到实际提取中的可操作性,最优提取工艺优化为：纤维素酶用量1.60%、提取温度53 ℃、提取时间68 min、液料比52∶1,辣木多糖提取率预测值为20.06%。在此条件下对模型预测条件进行验证,经过3次平行试验,实际多糖提取率为19.83%±1.35%,相对误差为0.0145,实测值与预测值差异较小,说明此方法可以较好地对辣木多糖的提取工艺进行优化,回归模型可靠性高。
2.4 辣木不同部位的多糖含量
不同小写字母表示在0.05水平下差异显著,不同大写字母表示在0.01水平下差异极显著。
Different lowercase letters mean significant difference at the 0.05 level; different capital letters mean extremely significant difference at the 0.01 level.
3 讨论
本研究采用二次回归旋转组合设计对纤维素酶辅助提取辣木多糖的主要影响因素进行优化试验,并建立回归模型。结果表明,回归模型拟合度较好,具科学性、可靠性;纤维素酶用量、提取温度、料液比对辣木多糖的提取率有极显著影响。
目前,有关辣木多糖的提取方法研究主要为水提法及超声波提取法等[9, 12]。水提法提取长、能耗大,且提取率较低;超声波提取法虽提取率较高,但因设备成本高,工业化生产难度较大。酶法辅助浸提是利用酶的高度专一性,在合适的条件下,使植物细胞壁破裂,溶剂充分进入细胞内将活性成分溶出,从而达到提高提取率的目的;此外,酶法浸提反应条件温和,可有效保持多糖的生物活性。本研究利用纤维素酶对辣木细胞中的纤维素、半纤维素等的降解作用对多糖进行提取,在纤维素酶用量1.60%、提取温度53 ℃、提取时间68 min、液料比52∶1条件下浸提,辣木多糖提取率平均值为19.83%,比梁鹏等[9]水提法所需的提取温度低、时间短且提取率高,比彭凌[12]超声波提取法所需提取温度低但提取时间长,与超声波提取法中除蛋白后的多糖含量相差不大。可见,采用酶法辅助浸提辣木多糖具有提取温度低、时间短、提取率高等优点。