由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起的枯萎病是香蕉种植中的毁灭性病害,对相关产业的健康发展具有重要影响[1]。抗病育种、化学农药、轮作等方法在对香蕉枯萎病的防治中均存在不同的缺陷,难以规模化推广应用。利用包括拮抗微生物在内的生物防治方法具有安全、环保、经济效益高等优点,是当前该类病害防治研究中的热点[2]。FS-4是本团队从香蕉枯萎病发病田土壤中分离筛选出的1株放线菌,其对香蕉枯萎病菌具有较好拮抗作用[3,4]。
本团队采用16S rDNA 序列分析其放线菌为曼尼普尔链霉菌（Streptomyces manipurensis）,命名为曼尼普尔链霉菌FS-4（Streptomyces manipurensis FS-4）[3,4]。采用国际链霉菌规划中的标准培养基（1976）,28 ℃培养7~21 d,观察FS-4菌株培养特征。结果发现：FS-4菌株能使硝酸盐还原,淀粉水解,能产生H2S、黑色素、尿素酶和酪氨酸酶,但不能使明胶液化、牛奶胨化与凝固。生长pH范围为5.0~10.0,最适生长pH为7.0。最适生长温度为28~32 ℃,不能生长在NaCl含量大于3%的培养基。FS-4菌株对香蕉枯萎病1号（Foc 1）和4号（Foc 4）小种均有拮抗作用,对香蕉枯萎病菌1号小种的拮抗性较弱,显著低于香蕉枯萎病菌4号小种,2者的抑菌带宽度分别为12.07和15.12 mm。
菌株FS-4在人工培养条件下生长缓慢,制约了相关研究工作的进行。响应面分析法通过研究响应输出结果与影响因子之间的数学关联模式,经由设计者在所关心的试验区域内以系统的方式进行试验,最终得到所设想的响应值和影响因子变化趋势,是一类包含了数学应用、统计处理和试验设计的分析工具[5],近年来在微生物发酵工艺研究中得到广泛应用。为更好地开展FS-4拮抗作用机理及其田间应用研究,本研究采用响应面分析法开展FS-4菌株的发酵工艺筛选研究。
1 材料与方法
1.1 材料
拮抗放线菌菌株FS-4和香蕉枯萎病菌菌株Foc 4由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所提供。高氏1号培养基和营养肉汤培养基参照王小琴等[6]的方法制备,相关试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
将氯化钠、磷酸氢二钾和硫酸镁含量分别调为0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%,筛选出最佳含量。设置培养基初始pH为 5、6、7、8和9,发酵温度为22、25、28、31和34 ℃,发酵时间为48、72、96、120和144 h,分别筛选出最佳参数。
表1 Box-Behnken实验因素水平表Tab. 1 Box-Behnken experimental for factor and level |
| 因素Factor | 水平Level | ||
|---|---|---|---|
| -1 | 0 | 1 | |
| A蛋白胨/% | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| B蔗糖/% | 1 | 2 | 3 |
| C时间/h | 24 | 48 | 72 |
1.3 数据处理
利用Design-Expert软件进行3因素3水平的Box-Behnken实验设计。所有实验均为3次重复,使用SPSS19.0软件进行统计学方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
图1 碳源对FS-4菌株产生抑菌物质的影响不同小写字母表示差异分析达到5%显著水平。 Fig. 1 Effect of carbon sources on activity of antimicrobial substance produced by FS-4 Difference lowercase letters represent 5% significant level. |
图3 氮源对FS-4菌株产抑菌物质的影响不同小写字母表示差异分析达到5%显著水平。 Fig. 3 Effect of nitrogen sources on activity of antimicrobial substance produced by FS-4 Different lowercase letters represent 5% significant level. |
2.1.3 氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁含量对放线菌FS-4产抑菌物质的影响 在高氏1号培养基的基础上进行了无机盐浓度的优化,结果表明,3种无机盐的不同浓度对放线菌FS-4抑菌物质的活性影响不大（图5）。
图6 pH对FS-4菌株产生抑菌物质的影响不同小写字母表示差异分析达到5%显著水平 Fig.6 Effect of pH on activity of antimicrobial substance produced by FS-4 Difference lowercase letters represent 5% significant level. |
图7 温度对FS-4菌株产生抑菌物质的影响不同小写字母表示差异分析达到5%显著水平。 Fig. 7 Effect of temperature on activity of antimicrobial substance produced by FS-4 Difference lowercase letters represent 5% significant level. |
2.2 响应面优化结果及分析
2.2.1 响应面结果 如表2所示,本研究对17个实验点进行分析。其中,12个点是析因点,5个点（实验号分别为1、5、8、10和17）用于计算实验误差的中心实验点。
表2 响应面结果表Tab. 2 Response surface design experimental results |
| 实验号 Experiment number | A | B | C | 抑菌圈直径 Inhibition zone diameter/mm |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 0 | 0 | 0 | 25.4 |
| 2 | 1 | 0 | -1 | 21.9 |
| 3 | 0 | 1 | -1 | 20.9 |
| 4 | -1 | -1 | 0 | 21.4 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 24.9 |
| 6 | -1 | 1 | 0 | 22.9 |
| 7 | -1 | 0 | 1 | 21.4 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 25.4 |
| 9 | 1 | -1 | 0 | 26.4 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 25.9 |
| 11 | 0 | 1 | 1 | 25.4 |
| 12 | 1 | 0 | 1 | 26.4 |
| 13 | 0 | -1 | 1 | 24.4 |
| 14 | 1 | 1 | 0 | 26.9 |
| 15 | 0 | -1 | -1 | 21.4 |
| 16 | -1 | 0 | -1 | 20.4 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 26.7 |
2.2.2 模型建立与方差分析 对响应面的结果进行多元回归拟合[16],得出抑菌圈直径为Y与蛋白胨浓度、蔗糖浓度、时间的二次多项回归方程为：
Y=25.26+1.94A+0.31B+1.63C–0.25AB+0.88AC+0.38BC–0.88A2–0.38B2–2.26C2
对回归方程模型进行方差分析,结果如表3所示。回归方程模型极显著,表明模型建立可信。模型的决定系数为0.9604,表明3.96%的实验数据不适合预测模型。模型的校正系数为0.9094,说明模型拟合程度良好,只有9.06%的实验数据的变异性不能解释。失拟项的P值是0.4386,不具有统计学差异,说明模型不需要引入更高次数的项。一次项A和C,二次项C2都达到极显著水平,交互项AC,二次项A2都达到显著水平。还可以得知3个因素对抑菌圈直径大小的影响顺序为：蛋白胨>蔗糖>时间。
表3 模型的方差分析Tab. 3 ANOVA for model analysis of variance |
| 方差来源 Sources of variation | 平方和 Quadratic sum | 自由度 Freedom | 均方 Mean square | F值 F value | P | 显著性 Conspicuousness |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 82.73 | 9 | 9.19 | 18.85 | 0.0004 | ** |
| A蛋白胨 | 30.03 | 1 | 30.03 | 61.57 | 0.0001 | ** |
| B蔗糖 | 0.78 | 1 | 0.78 | 1.60 | 0.2462 | |
| C时间 | 21.13 | 1 | 21.13 | 43.31 | 0.0003 | ** |
| AB | 0.25 | 1 | 0.25 | 0.51 | 0.4972 | |
| AC | 3.06 | 1 | 3.06 | 6.28 | 0.0407 | * |
| BC | 0.56 | 1 | 0.56 | 1.15 | 0.3185 | |
| A2 | 3.26 | 1 | 3.26 | 6.68 | 0.0362 | * |
| B2 | 0.61 | 1 | 0.61 | 1.25 | 0.3011 | |
| C2 | 21.41 | 1 | 21.41 | 43.89 | 0.0003 | ** |
| 残差 | 3.41 | 7 | 0.49 | |||
| 失拟项 | 1.56 | 3 | 0.52 | 1.12 | 0.4386 | |
| 纯误差 | 1.85 | 4 | 0.46 | |||
| 总和 | 86.15 | 16 |
Note: ** was extremely significant (P< 0.01); * was significant (P< 0.05); not significant (P > 0.05). R2=0.9604; R2adj=0.9094. | |
注：**为极显著（P值<0.01）;*为显著（P值<0.05）;不显著（P值>0.05）;R2=0.9604;R2adj=0.9094。 |
当蔗糖含量和时间一定时,抑菌圈的直径与蛋白胨含量成正相关,而蔗糖和蛋白胨含量一定时,抑菌圈的直径随着时间的延长先增大后减小,两者交互作用明显。时间在56~64 h内,蛋白胨含量在0.45%~0.50%范围内,抑菌圈的直径达到最大（图10）。
当蛋白胨含量和时间一定时,抑菌圈的直径与蔗糖含量成正相关,但增长趋势较缓。当蔗糖和蛋白胨含量一定时,抑菌圈的直径随着时间的延长先增大后减小,说明超过一定发酵时间后,发酵液中抑菌物质活性会降低,且蔗糖和蛋白胨交互作用不明显。时间在56~64 h内,蛋白胨含量在2.50%~3.00%范围内,抑菌圈的直径达到最大（图11）。
2.2.4 放线菌FS-4发酵培养基及发酵条件的优化和可靠性验证 通过Design-Expert V8.0.6软件分析得到最佳条件为：蛋白胨含量0.5%,蔗糖2.37%,时间62.04 h。在此条件下,抑菌圈的理论直径为27.46 mm。为简化实验操作,将条件修正为蛋白胨浓度0.5%,蔗糖浓度2.4%,时间62 h。实际得到抑菌圈直径27.1 mm,与预测理论值相近。因此,得出的最佳条件具有较好的实用价值。
3 讨论
抗菌活性物质通常作为拮抗放线菌发挥生物防治作用的物质基础,其产量的高低影响着抑菌的实际效果[15, 19]。发酵是获得大量微生物活性代谢产物的基础,微生物代谢产物的类型和产量与其培养条件,如培养基中的碳源、氮源、pH等密切相关[20,21],因此,探索出适宜的培养条件尤为关键。研究表明,不同培养基配方对菌株抑菌活性有较大影响[22,23]。程沁园等[24]研究的放线菌菌株WB-F以葡萄糖为碳源,黄豆粉为氮源时,单体积发酵液抑菌直径提高了23.1%。朱宏建等[25]发现的放线菌菌株ND045在碳源为蔗糖、氮源为大豆粉时,菌株发酵滤液对辣椒尖孢炭疽病菌（Colletotrichum acutata）的抑菌率为35.2%。另外,发酵时间对放线菌FS-4产抑菌物质也会产生影响。在本研究中,由图8可知24 h的发酵液里已有抑菌物质,当发酵48 h后,抑菌圈直径不再增加,说明放线菌FS-4基本停止产生抑菌物质或者抑菌物质的活性下降。
发酵工艺中的每一步、每个环节都至关重要。传统的正交试验设计、全因子试验设计等手段优化微生物发酵工艺,实验工作量较大,结果也不全面。而响应面法能很好地对影响发酵工艺过程中的培养基、培养条件等进行优化和评价[26]。本研究采用响应面实验进行发酵条件的优化,与优化前相比,菌株FS-4抑菌直径增加了26.1%。不同发酵条件对菌株发酵液抑菌活性有一定影响。本研究得到菌株FS-4最优发酵条件为：蛋白胨0.5%,蔗糖2.4%,时间62 h,发酵温度28 ℃,发酵pH为7,磷酸氢二钾、氯化钠和硫酸镁为0.05%。这与莫坤联[27]从抗香蕉枯萎病菌放线菌BWL58及BWL15-4菌株的最优发酵条件存在一定差异,其原因可能是不同菌株对于发酵过程中各理化因素需求不同的表现,也可能是生理代谢途径因菌种差异的体现。
微生物发酵是个动态的生物学过程,培养基中各养分含量、pH、容氧量和产物量一直处于不断变化,不同因素的变化会对发酵产物的种类和产量均有较大的影响[27]。本研究仅考虑了发酵前的培养基状态和培养条件,未对发酵过程各因素进行动态监控,在后续的研究中,应采用生物化学分子生物学等方法对目标菌株的代谢动态过程进行深入研究,探讨培养基的各养分含量与目标活性物质产量及培养条件之间的关系,进而提高目标活性物质的产率。