甘蔗黑穗病（sugarcane smut）是由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的,是一种茎寄生真菌病害,目前推断我国可能存在3个生理小种[1]。发病蔗株受侵染后,从蔗茎生长点中抽出黑色鞭状物,长短不一,鞭上有薄膜状覆盖物。破裂后,露出无数冬孢子,如煤烟层,随风传播,严重影响甘蔗的产量,成为甘蔗主要病害之一。植蔗主产国因黑穗病而先后淘汰曾经的当家品种（N:Co310和F134等）。目前,多个国家把甘蔗无性系对黑穗病的抗性作为选育甘蔗优良品种的主要指标。
广西是中国最大的糖业生产基地,独特的地理位置和气候条件非常适宜种植甘蔗,全区甘蔗面积66.7多万公顷,主栽品种ROC22的种植面积占全区甘蔗种植面积的60%[2]。但ROC22普遍感染黑穗病,田间发病率约为10%,严重发生地块的宿根发病率超过50%[3,4]。主栽品种其次为柳城05-136和桂糖42号[5],均感黑穗病[2, 6],宿根年限越长发病越严重。防治甘蔗黑穗病最经济有效的方法是选育推广抗病品种,抗病性鉴定是选育抗黑穗病品种的一个重要程序。本研究通过对桂糖甘蔗新品系进行人工接种黑穗病菌和大田自然发病对比试验,测定甘蔗新品系对黑穗病的抗性,调查一新一宿黑穗病发病情况,综合评价新品系的抗性水平,为选育高产高糖高抗品种提供依据,确保甘蔗种植业和蔗糖业持续稳定的健康发展。
1 材料与方法
1.1 参试品系
参试材料为8个甘蔗桂糖新品系：桂糖12-162、桂糖12-762、桂糖12-765、桂糖12-917、桂糖12-2004、桂糖12-2262、桂糖12-2425、桂糖12-2476;对照品种为ROC22。供试品种砍成双芽节,备用。
1.2 甘蔗黑粉菌冬孢子采集及保存
于2016年4—5月份,从广西农科院甘蔗所丁当基地和南宁试验基地的蔗地,用剪刀采集多品种自然发病的蔗株抽出的新鲜黑穗鞭子（鞭子上的包膜刚破裂的为最佳）,平铺于室内的报纸上,自然晾干5~6 d,然后轻微抖动及用毛刷将各鞭子上的黑色粉状孢子收集,将混合孢子粉分装于自封袋中,约10 g/袋。
1.3 甘蔗黑粉菌活性试验
取-20 ℃冰箱冷冻的黑穗孢子粉于4 ℃冰箱24 h,然后用灭菌后的牙签沾取微量孢子粉,加入到已有无菌水的2 mL离心管中,充分混匀,经28 ℃琼脂蔗糖培养基平板培养8~12 h,观察冬孢子菌丝的生长状况。
1.4 试验方法
对参试品系进行人工接种黑粉菌混合冬孢子悬浮液,对照为广西主栽品种ROC22,结合一新一宿黑穗病发病结果,综合评价桂糖新品系甘蔗对黑穗病的抗性。
1.4.1 接种 采用浸种法进行人工接种。用检验合格（孢子萌发率>90%）的黑穗孢子粉配制成浓度约为5×106个/mL的孢子悬浮液,配制方法及浓度参考沈万宽等[1]的方法。将每个品系的蔗种浸泡在配制好的孢子悬浮液中30 min（孢子悬浮液使用不超过4 h,超过的则需另外再配制）,取出后放入塑料桶内,最后用塑料薄膜盖住塑料桶,绳子扎紧边缘,于温室（室温约28 ℃）内保温保湿催芽24 h后种植于试验田。
1.4.2 试验设计 于2017年2月27日种植于南宁隆安县甘蔗所丁当基地,小区设置为3行区,行长5 m,行距1.2 m,小区面积18 m2,随机区组排列,3次重复,每行种植64个芽,人工摆种种植,盖土并喷施封闭性除草剂后盖膜,促进发芽,田间管理按基地大田生产方法进行,2018年3月收获后保留宿根,继续观察。
1.4.3 调查方法 调查内容主要有：下种量、出苗数、黑穗病发病潜伏期和黑穗病发病茎数。黑穗病病茎调查方法如下：甘蔗萌芽结束后调查记录每个小区的出苗数。供试材料中抽出第1株黑穗始至6个月株龄止,发病起约15 d调查1次,每次调查记录各参试材料每个小区发病的黑穗茎数,记录数据后将病株连根拔除,以免重复记载。在调查终期,合计发病茎数及总茎数,计算供试材料的茎发病率。宿根蔗黑穗病调查方法同上。
1.5 甘蔗抗黑穗病抗性分级标准
2 结果与分析
2.1 供试甘蔗新品系新植人工接种和大田自然发病对黑穗病的抗性表现
根据供试品系抗性鉴定结果（表2）,8个甘蔗品系新植蔗的人工接种黑穗病抗性在4个抗性反应类型之间分布为HR至MS,抗性级别为1的品系有1个,为桂糖12-2262,最高发病率为2.91%,占参试品系的比例为12.50%,抗性类型为HR。抗性级别为3的品系有1个,为桂糖12-765,最高发病率为8.59%,占参试品系的比例为12.50%,抗性类型为R。抗性级别为4的品系有2个,为桂糖12-2476和桂糖12-2004,最高发病率分别为12.07%和9.68%,占参试品系的比例为25.00%,抗性类型为MR。抗性级别为5的品系有3个,分别为桂糖12-762、桂糖12-2425和桂糖12-162,最高发病率分别为20.17%,18.97%和13.25%,占参试品系的比例为37.50%,抗性类型为MS。对照品种ROC22的抗性级别为5,抗性类型为MS,最高发病率为13.00%。
表2 桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定结果Tab. 2 Resistant identification result of smut in GT sugarcane clones |
| 新植New plant | 宿根Ratoon | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 品系 Clones | 亲本组合 Parents | 处理 Treatment | 最高发 病率 Maximum incidence/% | 抗性级别Resistance grade | 抗性类型Resistance types | 潜伏期Incubation period/d | 最高发病率Maximum incidence /% | 抗性级别Resistance grade | 抗性类型Resistance types | 新宿对比Comparison of new plant and ratoon | 综合抗性水平Comprehensive resistance level |
| 桂糖12-765 GT12-765 | RB83-5089×桂糖02-901 | 人工接种 | 8.59 | 3 | R | 63 | 7.03 | 2 | R | +1 | R |
| 自然发病 | 0 | 1 | HR | - | 3.81 | 1 | HR | 0 | |||
| 桂糖12-762 GT12-762 | 桂糖97-182×粤糖91-976 | 人工接种 | 20.17 | 5 | MS | 46 | 36.76 | 6 | S | -1 | S |
| 自然发病 | 4.17 | 2 | R | 63 | 13.26 | 3 | R | -1 | |||
| 桂糖12-2425 GT12-2425 | 桂糖94-119× ROC23 | 人工接种 | 18.97 | 5 | MS | 63 | 44.98 | 7 | S | -2 | S |
| 自然发病 | 6.32 | 2 | R | 63 | 16.81 | 4 | MR | -2 | |||
| 桂糖12-2476 GT12-2476 | 粤糖85-177×桂糖73-167 | 人工接种 | 12.07 | 4 | MR | 63 | 17.24 | 4 | MR | 0 | MR |
| 自然发病 | 0.85 | 1 | HR | 115 | 2.47 | 1 | HR | 0 | |||
| 桂糖12-2004 GT12-2004 | 科5×桂糖02-901 | 人工接种 | 9.68 | 4 | MR | 78 | 17.39 | 4 | MR | 0 | MR |
| 自然发病 | 0 | 1 | HR | - | 0.90 | 1 | HR | 0 | |||
| 桂糖12-917 GT12-917 | 桂糖02-208×粤糖00-236 | 人工接种 | 26.58 | 6 | S | 46 | 22.57 | 5 | MS | +1 | S |
| 自然发病 | 0 | 1 | HR | - | 4.46 | 1 | HR | 0 | |||
| 桂糖12-2262 GT12-2262 | 桂糖04-107×桂糖04-120 | 人工接种 | 2.91 | 2 | HR | 115 | 6.60 | 2 | R | 0 | R |
| 自然发病 | 0 | 1 | HR | - | 8.53 | 2 | R | -1 | |||
| 桂糖12-162 GT12-162 | 粤糖94- 128×农林8 | 人工接种 | 13.25 | 5 | MS | 46 | 8.05 | 2 | R | +3 | MS |
| 自然发病 | 0 | 1 | HR | - | 4.88 | 1 | HR | 0 | |||
| ROC22 | ROC5号× 69-463 | 人工接种 | 13.00 | 5 | MS | 46 | 37.36 | 6 | S | -1 | S |
| 自然发病 | 6.35 | 2 | R | 63 | 41.54 | 7 | S | -5 | |||
Note: “+” indicates that the resistance level of ratoon was advanced; “-” indicates that the resistance level of ratoon was lower; “0” indicates that the resistance level of new plant and ratoon were same; The number of behind in “+” or “-” mean was the range of resistance level change. | |
注：“+”表示宿根抗病性水平提高;“-”表示宿根抗病性水平降低;“0”表示新宿根抗性水平不变;“+”或 “-”后面的数字表示抗性变化的幅度。 |
8个甘蔗品系新植蔗的大田自然发病抗性只有2个反应类型,为HR和R,抗性级别为1的品系有6个,分别为桂糖12-765、桂糖12-2476、桂糖12-2004、桂糖12-917、桂糖12-2262和桂糖12-162,最高发病率在0%~0.85%之间,占参试品系的比例为75.00%,抗性类型为HR。抗性级别为2的品系有2个,分别为桂糖12-762和桂糖12-2425,最高发病率为4.17%~6.32%,占参试品系的比例为25.00%,抗性类型为R。对照品种ROC22的大田自然发病率最高为6.35%,抗性级别为2,抗性反应类型为R。
2.2 供试甘蔗新品系甘蔗黑穗病发病潜伏期
甘蔗种苗种植到第1株黑穗病表现症状的时间为黑穗病发病潜伏期。试验结果表明（表2）,人工接种黑穗病的潜伏期在不同品系之间有差异。人工接种的潜伏期从最短的46 d,到最长101 d,相差55 d。发病潜伏期为46 d的有3个品系：桂糖12-7624、桂糖12-917和桂糖12-162,抗性级别为5和6,抗性类型为MS和S,占参试品种的比例为37.5%。发病潜伏期为63 d的有3个品系：桂糖12-765、桂糖12-2425和桂糖12-2476,抗性级别为3、4和5,抗性类型分别为R、MR和MS,占参试品种的比例为37.5%。发病潜伏期为78 d的有1个品系：桂糖12-2004,抗性级别为4,抗性类型为MR,占参试品种的比例为12.5%。发病潜伏期为115 d的有1个品系：桂糖12-2262,抗性级别为2,抗性类型为HR,占参试品种的比例为12.5%。
大田自然发病中,未发病的品系有5个,分别为桂糖12-765、桂糖12-2004、桂糖12-917、桂糖12-2262和桂糖12-162,抗性类型为HR,抗性级别为1,占参试品种的比例为62.5%。发病潜伏期为63 d的有2个品系,分别为桂糖12-762和桂糖12-2425,抗性类型为R,抗性级别为2,占参试品种的比例为25.00%。
对照品种ROC22的人工接种黑穗发病潜伏期为46 d,抗性级别为5,抗性类型为MS。大田自然发病的潜伏期为63 d,抗性级别为2,抗性类型为R。对比人工接种黑穗病发病的潜伏期和该品系抗黑穗病的关系,大部分品系对黑穗病的抗性和潜伏期长短呈正相关的趋势,即发病潜伏期短的品系抗病性弱,反之,发病潜伏期长的品系抗病性强。
2.3 桂糖新品系宿根蔗人工接种和大田自然发病对甘蔗黑穗病的抗病性评价
根据供试品系宿根的抗性鉴定结果（表2）,8个甘蔗品系宿根蔗的人工接种黑穗病抗性的抗性反应类型在R至MS之间分布、抗性级别在2~7等级之间分布。抗性级别为2的品系有3个,为桂糖12-765、桂糖12-2262和桂糖12-162,最高发病率分别为7.03%、6.60%和8.05%,占参试品系的比例为37.50%,抗性类型为R。抗性级别为4的品系有2个,分别为桂糖12-2476和桂糖12-2004,最高发病率分别为17.24%和17.39%,占参试品系的比例为25.00%,抗性类型为MR。抗性级别为5的品系有1个,为桂糖12-917,最高发病率为22.57%,占参试品系的比例为12.50%,抗性类型为MS。抗性级别为6的品系有1个,为桂糖12-762,最高发病率分别为36.76%,占参试品系的比例为12.50%,抗性类型为S。抗性级别为7的品系有1个,为桂糖12-2425,最高发病率为44.98%,占参试品系的比例为12.50%,抗性类型为S。对照品种ROC22的宿根人工接种黑穗抗病级别为6,最高发病率为37.36%,抗性类型为S。
8个甘蔗品系宿根蔗的大田自然发病抗性反应类型在HR和MR之间。抗性反应类型为HR的品系有5个,为桂糖12-765、桂糖12-2476、桂糖12-2004、桂糖12-917和桂糖12-162,最高发病率在0.90%~4.88%之间,占参试品种的比例为62.50%。抗性反应类型为R的品系有2个,最高发病率为13.26%和8.53%,占参试品种的比例为25.00%;抗性反应类型为MR的品系有1个,为最高发病率为16.81%,占参试品种的比例为12.50%。对照品种ROC22的大田自然最高发病率为41.54%,抗性级别为7,抗性反应类型为S。
桂糖12-2262宿根蔗人工接种和田间自然发病的抗性不变,其余7个甘蔗品系的抗性均是人工接种抗性低于大田自然发病的抗性。
2.4 桂糖品系新植、宿根人工接种黑穗病抗性评价结果对比
根据同1个甘蔗品系的新植与宿根、人工接种与大田自然发病抗黑穗病的评价结果比较（表2）,相同甘蔗品系人工接种黑穗病的新宿根抗性水平对比,8个甘蔗品系中,3个品系的新植与宿根的抗性等级相同,为桂糖12-2476、桂糖12-2004和桂糖12-2262,占参试品种的比例为37.50%。3个品系的宿根抗性等级比新植抗性等级提高,为桂糖12-765、桂糖12-917和桂糖12-162,提高幅度为1~3个等级,占参试品系的比例为37.5%。有2个品系的宿根抗性等级比新植抗性等级降低,分别为桂糖12-762和桂糖12-2425,降低幅度为1~2个等级,占参试品系的比例为25.00%。对照品种ROC22,人工接种黑穗病的宿根比新植的抗性等级降低1个级别。
大田自然发病条件下,相同甘蔗品系的新宿根抗性水平对比,8个甘蔗品系中,有5个甘蔗品系的抗性水平保持不变,抗性类型均为HR,分别为桂糖12-765、桂糖12-2476、桂糖12-2004、桂糖12-917和桂糖12-162,占参试品系的比例为62.5%;有3个品系的宿根抗性等级比新植抗性等级降低,降低幅度1~2个等级,分别为桂糖12-762、桂糖12-2425和桂糖12-2262,占参试品系的比例为37.50%。对照品种ROC22,田间自然发病的宿根抗性等级比新植的提高了5个级别,发病率由新植的6.35%增加到宿根的41.54%。
人工接种的桂糖品系新植和宿根的抗性水平有的提高,有的降低,说明甘蔗抗黑穗病的抗性新植和宿根不同,这与生产中甘蔗品种的新植蔗黑穗病抗性不同于宿根蔗抗性的结果一致。
2.5 桂糖品系综合抗性评价结果
综合同一品系新植、宿根在人工接种和大田自然发病条件下不同的抗性评价结果（表2）,选取抗性等级最高和抗性类型最低的为综合抗性评价结果。8个参试品系中,综合抗性类型在R、MR、MS和S等4个抗性类型之间分布,抗性类型为R的品系有2个,为桂糖12-765和桂糖12-2262,占参试品种的比例为25.00%。综合抗性类型为MR的品系有2个,分别为桂糖12-2476和桂糖12-2004,占参试品系的比例为25.00%。综合抗性类型为MS的品系有1个,为桂糖12-162,占参试品系的比例为12.50%。综合抗性类型为S的品系有3个,分别为桂糖12-762、桂糖12-2425和桂糖12-917,占参试品系的比例为37.50%。对照品种‘ROC22的综合抗性类型为S。
综合人工接种和大田自然发病一新一宿抗性结果,参与试验的8个桂糖新品系的综合抗性均与人工接种抗性在同一抗性类型,且有6个品系与人工接种的宿根抗性同一类型,由此可得,参试品系的人工接种宿根抗性类型可以作为评价该品系对黑穗病的最终抗性类型。
3 讨论
本试验利用相同的甘蔗材料,通过人工接种和田间自然诱发的方式,使甘蔗品系感病。试验结果表明,不同的接种条件的抗性表现不同,人工接种甘蔗品系发病率高于田间自然发病。田间自然发病方法虽然简便,但是容易受环境、病原等因素影响,较仍接种方法不能准确的评价品种的抗病性。人工接种能更加真实有效的评价甘蔗品系对黑穗病的抗性水平。
甘蔗生产中,甘蔗黑穗病菌在田间逐年积累,随着宿根年限的延长,甘蔗黑穗病的发病严重程度逐年加重,因此,甘蔗宿根的黑穗病发病率一般会高于新植的黑穗病发病率。本研究的参试品系中,37.5%品系的宿根发病率低于新植发病率,其可能与甘蔗对黑穗病的抗性跟寄主、病原菌、环境等因素有关。调查发病率时,对发病茎连根拔除,其操作减少田间黑穗病菌的病源,大大降低了宿根蔗的初次受侵染水平,其结论与沈万宽等[1]的结论一致。
大田黑穗病发病率的调查记录一般有发病株（丛）和发病茎2种方法,不同的计算方法对甘蔗的黑穗病发病率有重要影响。理论上发病丛率更加准确,因为在记录发病的茎数时,不管是否拨掉发病茎（保留蔗根）,发病茎的甘蔗分蘖绝大部分是黑穗病株。甘蔗感染黑穗病后,发病茎会刺激分蘖的产生,当再次调查发病茎的时候,是否把感染黑穗的分蘖记录为发病茎将是影响甘蔗整体发病率的一个重要因素。但在正常栽培管理下,如果大田试验中调查记录黑穗发病丛,由于宿根的时候很难区别甘蔗丛数,对记录甘蔗黑穗病的发病丛数增加了困难,所以大部分大田试验中新植和宿根调查是发病茎的数量,室内盆栽或者只有新植的试验,才会计算发病丛。本研究还发现,不同甘蔗品种感染黑穗病的情况不同。有的品种在有效茎上抽出黑穗鞭子,甚至有效茎株高达1.5~2.5 m还能在生长点抽出黑穗鞭子,其品种黑穗发病率低,但对甘蔗产量的影响大。有些品种甘蔗黑穗只发生在茎的侧芽,黑穗病发病率高但是对甘蔗产量影响不大。有的品种感染黑穗的病株是单株分散型,每丛甘蔗只有1~2株黑穗株。有的品种则1个试验小区只有1丛甘蔗发病,其发病的甘蔗丛中有数10根细小分蘖均为黑穗株。其是否与甘蔗黑穗病菌的不同生理小种对不同甘蔗品种的发病情况不同有关,有待我们进一步的研究。
多年来广西甘蔗黑穗病发生严重,主栽品种及近年来主推品种的黑穗病发生率亦居高不下[10],其导致黑穗病成为广西甘蔗乃至中国甘蔗的一大难题。抗病育种成为了防治黑穗病的重中之重。本研究中,黑穗病抗性评价所采用的抗性分级标准是参照夏威夷甘蔗黑穗病抗性分级标准[11,12]来制定的中国农业部甘蔗育种“九五”攻关项目病害制定的统一分级标准,其分级标准对评价甘蔗新品种的抗病性过于宽松。随着抗病育种的发展,目前国际上甘蔗主要生产国对甘蔗黑穗病的抗性等级划分均趋于严格化,黑穗病的等级划分无论是分9个等级还是5个等级,大部分均以发病率为10%左右作为抗病（R）等级的划分,这说明全球甘蔗育种对甘蔗新品种抗黑穗病筛选的重视,将对控制甘蔗黑穗病在全世界的发生起到重要的作用。今后,期望通过严格的抗病育种程序及高标准的评价等级,培育出高产高糖高抗黑穗病的甘蔗新品种,为糖业产业做出贡献。