蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）属于兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）植物,原产于热带和亚热带。因花型优美奇特、花期长,具有较高的观赏价值,在我国南方和北方各地均有栽培。但不管在南方或北方,蝴蝶兰的种植均需盆栽,且需在温室进行精细的温湿度管理,以满足其生长必须的温湿环境和花期调控条件。因此,培育有较高的观赏性状、又有较强抗逆性品种,特别是培育抗冷性品种是蝴蝶兰引种栽培、降低成本的一条捷径。研究表明,适当的夜间低温能够诱导蝴蝶兰生殖发育相关基因的表达以促进开花[1],而大部分蝴蝶兰品种的耐受极限夜温为9 ℃以下[2]。不同耐冷性蝴蝶兰在低温胁迫下其叶绿素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶、过氧化氢酶活性及光合生理等参数均具有差异性响应特征[2,3]。同时,低温胁迫也会诱导逆境响应蛋白的差异表达[4]。一些基因如Rubisco活化酶基因PhRCAα[5]、茎部特异基因PhTSJT1[6]等能够参与低温胁迫的调控,使蝴蝶兰在低温胁迫的早期表现一定的耐受性和适应性。由此可见,研究一些逆境调控基因及其功能将为利用基因工程手段进行分子育种奠定基础。
亲环素（cyclophilin）是亲免素家族的一员,与环孢素A（cyclosporineA, CsA）高度亲和,具有肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis- trans-isomerase, PPIase）活性,能够催化脯氨酸肽键的顺-反异构化[7]。亲环素具有一个类亲环素（cyclophilin-like domain, CLD）保守结构域,除此之外,在其N端或C端还有一些特异序列,与亚细胞定位等细胞特定功能有关[8]。亲环素是一个多功能蛋白家族,广泛分布于细菌、病毒、真菌、动物及植物等有机生物体中,定位于细胞核、细胞质、内质网、叶绿体、线粒体、液泡、高尔基体及分泌途径等亚细胞场所[9,10]。据报道,植物中存在多种同工型亲环素蛋白,其参与蛋白的折叠和转运[11,12]、信号转导[13,14]、免疫调节[15,16,17]、细胞凋亡[18]等多种重要的生理生化过程。由于亲环素在植物各种组织中的普遍表达,亲环素基因常作为动植物基因表达研究的候选内参基因[19,20,21]。而近年来的研究表明,植物亲环素基因参与干旱[22]、高盐[23,24]及低温[25,26]等多种逆境胁迫的调控,是一个逆境胁迫调控蛋白。迄今为止,在拟南芥[18]、大豆[27]、油菜[28]等多种植物中已分离出多个亲环素基因及其同工型,而蝴蝶兰亲环素基因的研究还未见报道。因此,本研究用RT-PCR和RACE方法,从蝴蝶兰叶片中克隆一个亲环素基因的全长序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量方法检测其在蝴蝶兰不同组织及低温胁迫下的转录表达水平,研究结果将为进一步研究亲环素基因的功能及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰栽培品种：‘聚宝红玫瑰’和‘满天红’,其均种植于郑州师范学院智能温室。
取‘聚宝红玫瑰’4个发育时期的15种组织为试验材料,包括幼苗期的根和叶片,开花前期的根、叶片和花梗,盛花期的根、叶片、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱、授粉前子房,授粉后的发育中子房、果实成熟时的种子等材料。将‘满天红’幼苗在光照培养箱中进行13 ℃/8 ℃（昼/夜）温度（12 h/12 h 昼/夜光照）培养,随后进行27 ℃/22 ℃（昼/夜）及12 h/12 h 昼/夜光照恢复培养。在冰箱中进行4 ℃低温处理。分别于13 ℃/ 8 ℃温度条件下的0、1、3、6、9、15 d及恢复培养条件下的1和3 d取第2叶片组织;4 ℃低温条件取0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h的第2叶片组织。每种组织及处理设3个生物学重复,所取样品用液氮速冻,放于-80 ℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成 蝴蝶兰不同组织的总RNA采用TRIzol Reagent（Ambion）提取,‘聚宝红玫瑰’幼苗期叶片总RNA用M-MLV反转录酶（TaKaRa）合成cDNA,用于PhCyP基因克隆。实时荧光定量PCR所用cDNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）合成,稀释10倍备用。
1.2.2 蝴蝶兰PhCyP基因的克隆 根据NCBI上登录的同源序列（XM_020833376、KP719975、KU942511、XM_020728710、GU942927）设计1对简并引物CyP-F和CyP-R,用于中间片段的扩增,预期452 bp,PCR扩增体系为25 μL,含10×buffer 2.5 μL,cDNA模板1000~2000 ng,dNTP 600 μmol/L,每条引物0.5 μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U。扩增程序为：95 ℃变性5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。凝胶回收目的片段,连接到pGEM-T EASY载体上,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,进行测序。根据中间片段设计3°端特异引物3°-outer和3°-inner,5°端特异引物5°-outer和5°-inner,采用SMARTTM RACE Amplification kit（Clontech）进行目的基因的RACE扩增。将5°端序列、中间序列和3°端序列拼接,获得目的基因cDNA的全长。在此基础上,设计1对引物ORFF和ORFR,跨越开放阅读框（ORF）,预期691 bp,进行ORF的扩增和测序,进一步进行序列验证。引物设计和序列拼接采用Primer 5.0和DNAMAN软件,引物合成和测序由上海英潍捷基公司完成。
表1 引物序列Tab. 1 Primers and sequence |
| 引物 Primer | 序列(5'-3') Sequence(5'-3') |
|---|---|
| CyP-F | TKATCCCTCAGTTYATGTGCC |
| CyP-R | CGATRCAGAACGGAAACCAACAC |
| 3'-inner | CTTGGCTCGATGGAAAGCATG |
| 3'-outer | GAACGGTTCCCAGTTCTTTATC |
| 5'-inner | TAAGAGATCTGGCCACAGTCAGC |
| 5'-outer | GCCAAATACAACATGCTTTCCATC |
| ORFF | GGACTGCAAGGCAAGCAAAC |
| ORFR | CGATACAGAACGGAAACCAACAC |
| qRT-F | ATCCCTCAGTTCATGTGCCAG |
| qRT-R | GAATTGCCTTCACAACATCCAG |
| Actin-F | GCAGCATGAAGATCA AGGTGG |
| Actin-R | GCCTTAGAAATCCACATCTGTTG |
1.2.3 蝴蝶兰PhCyP基因的生物信息学分析 在NCBI上通过ORF Finder在线分析序列开放阅读框。PhCyP基因的核苷酸序列采用Blast进行分析。蛋白结构域分析利用PROSITE（https://prosite. expasy.org/scanprosite/）进行。PhCyP基因编码蛋白的理化性质和二级结构采用ExPASy网站进行在线预测。采用Phyre2软件进行三级结构预测。采用WoLFPSORT软件进行亚细胞定位预测。跨膜结构采用TMHMM-2.0进行分析。利用ClustalX软件对氨基酸序列进行完全比对,并在MEGA 5.0软件上采用邻接法构建系统进化树。
1.2.4 蝴蝶兰PhCyP基因的表达分析 根据PhCyP基因编码区序列设计1对特异引物qRT-F和qRT-R,以蝴蝶兰Actin（JN185655）为内参基因,引物为Actin-F和Actin-R,采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit （TaKaRa）进行实时荧光定量PCR反应,反应体系为25 μL,反应条件为：95 ℃3 min,95 ℃15 s,58 ℃15 s,72 ℃15 s（40个循环）。反应在荧光定量PCR仪（Eppendorf）上进行,每个反应重复3次。引物特异性通过溶解曲线分析并测序验证,相对表达量按照2-ΔΔCT法计算,表达差异通过SPSS 20.0软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰PhCyP基因的克隆
以幼苗期蝴蝶兰叶片cDNA为模板,利用简并引物CyP-F和CyP-R进行PCR扩增,预期得到了一个452 bp的片段（图1A）,该片段与多种植物的肽基脯氨酰顺反异构酶基因或亲环素基因具有76%~98%的一致性。5° RACE和3° RACE扩增结果分别得到一个607 bp（图1B）和398 bp（图1C）的片段,将其片段进行拼接得到一个829 bp的序列,ORF片段（图1D）的测序结果与拼接序列完全一致。其序列的ORF长度为522 bp,编码173 个氨基酸,5°端非编码区（5°- UTR）和3°端非编码区（3°-UTR）分别为49和258 bp（图2）。将PhCyP序列进行核苷酸Blast搜索,结果表明,其序列与小兰屿蝴蝶兰的肽基脯氨酰顺反异构酶基因（XM_020728710）具有98%的一致性,与万带兰的亲环素基因（GU942927）具有94%的一致性,与铁皮石斛（XM_020833376）和常春藤（KU942511）的肽基脯氨酰顺反异构酶基因序列的一致性分别为85%和80%。因此,将其序列命名为PhCyP,登录在NCBI网站,登录号为MH992514。
图1 PhCyP基因的克隆M: DL2000 Marker; A: Conserved region; B: 5° RACE; C: 3° RACE; D: ORF. Fig. 1 Cloning of PhCyP |
2.2 蝴蝶兰PhCyP基因的生物信息学分析
为进一步了解蝴蝶兰PhCyP蛋白的系统进化,选择一致性较高的亲环素蛋白构建进化树（图5）。结果表明,15种植物中亲环素蛋白进化树分为2个大的分支,其中1个分支包括十字花科的山萮菜、拟南芥和琴叶拟南芥、锦葵科的陆地棉和雷德蒙氏棉、蔷薇科的白梨、甜樱桃和月季聚、胡麻科的芝麻和豆科的大豆,以上植物均为双子叶植物,且同科植物的亲环素蛋白很明显聚在一起。另1分支包括兰科植物蝴蝶兰、小兰屿蝴蝶兰、万带兰、铁皮石斛和深圳拟兰。其中蝴蝶兰的亲环素蛋白与小兰屿蝴蝶兰的PPIase亲缘关系最近,与铁皮石斛和深圳拟兰的亲环素蛋白关系稍远。以上结果可以看出,亲环素蛋白在单子叶植物和双子叶植物中比较保守,其进化具有明显的种属特异性。
2.3 蝴蝶兰PhCyP基因的表达分析
PhCyP基因在不同发育时期的不同组织中均有表达,相对表达水平在0.69~1.00之间（图6）。在各种组织中,PhCyP基因的表达水平没有显著性差异,其说明PhCyP基因在不同组织中为组成型表达,在不同发育时期的不同组织中,表达水平相对稳定。
图6 PhCyP基因在不同组织中的表达1：幼苗期根;2：幼苗期叶;3：花前期根;4：花前期叶;5：花前期花梗;6：盛花期根;7：盛花期叶;8：盛花期花梗;9：花萼;10：花瓣;11：唇瓣;12：蕊柱;13：授粉前子房;14：发育中子房;15：种子。 Fig. 6 Expression level of PhCyP gene in different tissues 1: Root at seedling stage; 2: Leaf at seedling stage; 3: Root at pre-flowering stage;4: Leaf at pre-flowering stage; 5: Pedicel at pre-flowering stage; 6: Root at full-blossom stage;7: Leaf at full-blossom stage; 8: Pedicel at full-blossom stage; 9: Sepal; 10: Petal; 11: Lip; 12: Column;13: Ovary before pollination; 14: Developing ovary; 15: Seed. |
在13 ℃/8 ℃（昼/夜）条件下,PhCyP基因的表达水平随低温处理逐渐降低,6 d时下降到最低,6 d后其表达水平逐渐升高,升高趋势一直维持到恢复培养的3 d（图7）。
在4 ℃低温胁迫条件下,PhCyP基因的表达水平在处理的0.5、1、2、4 h内逐渐升高,在4 h时升至最高,随后其表达水平逐渐下降,至处理48 h表达水平下降到最低,表达水平只有处理前的一半（图8）。在驯化低温条件下,PhCyP基因在前期表达水平下降,后期表达水平升高,而在4 ℃冷胁迫条件下,其表达水平前期升高,后期表达水平下降。以上结果说明,低温驯化和短期的冷胁迫能够诱导PhCyP基因的表达以适应低温条件以及避免冷胁迫的伤害。
3 讨论
本研究在蝴蝶兰中克隆到一个亲环素基因PhCyP,其编码蛋白含有1个单结构域类型的CLD结构域。在蝴蝶兰不同发育时期和组织中,PhCyP基因具有较高表达水平。驯化低温条件下,PhCyP基因的转录表达先降低后升高,冷胁迫低温条件下,其表达呈现先升高后降低的趋势。
据报道,亲环素基因常作为动植物研究中常用的内参基因之一[19,20,21]。对马铃薯多个内参基因的稳定性研究表明,盐胁迫条件下,马铃薯亲环蛋白基因 CYP2表达最为稳定[30]。对大豆的10个常用内参基因（ACT2/7、ACT11、TUA、TUB、EF1α、UBC2、ELF1b、CYP2、G6PD、UBQ10）研究显示,亲环蛋白基因（CYP2）和延伸因子1b（ELF1b）在21个不同发育时期和组织器官等样本中的表达最为稳定,是表达最为稳定的内参基因[31]。Coker等[32]统计分析番茄EST数据库中的127个基因在不同cDNA文库中的出现频率,并据此来判断基因的表达稳定性,亲环素基因也是5个稳定性最好的基因之一。在蝴蝶兰内参基因稳定性表达研究中[33],还未见亲环素基因的报道。本研究结果表明,PhCyP基因在不同发育阶段和组织中均有较高丰度的表达,且表达水平基本一致。通常来说,PhCyP基因可作为正常生长条件下相关基因研究的候选内参基因,然而其基因的表达对环境温度较敏感,其表达水平随不同的低温胁迫发生变化,显然,低温胁迫下,亲环素基因不适合作为内参基因。
诸多研究已经证明,亲环素是一个逆境调控蛋白[22,23,24,25,26]。关于亲环素基因对低温胁迫的响应,早在1992年Marivet[34]的研究中已被证明,亲环素基因能被低温诱导上调表达。相同的结果也在野生马铃薯中得到验证[35]。对水稻亲环素基因研究发现,OsCYP19-4基因响应冷胁迫被上调表达,在水稻中过表达该基因能增强水稻对低温的抗性[26]。随后的研究表明,OsCYP19-4通过可变剪切产生4个转录本,其中OsCYP19-4.2和OsCYP19- 4.3通过与生长素途径相关因子RCN1互作在冷胁迫中发挥重要作用[36]。在低温诱导差异蛋白的研究中,也常常发现亲环素蛋白能被低温诱导,例如花生在低温胁迫下亲环素蛋白被上调表达,并在转录水平得到验证[37]。
本研究中蝴蝶兰在13 ℃/8 ℃条件下,其PhCyP基因的表达先降低,而后逐渐升高至恢复后。其表明该基因在后期（9 d）逐渐启动适应这一低温胁迫的调控,且增强了蝴蝶兰对驯化低温的抵抗能力。在4 ℃冷胁迫条件下,PhCyP基因的表达先升高后降低,在4 h时调控水平达到最高,随后其表达水平逐渐下降,至到48 h时下降到低于处理前的水平。其结果表明,PhCyP基因受到胁迫就启动避免冷胁迫的调控,调控持续一定时间后,其表达水平由于植株受到严重损伤或植株逐渐死亡而降低。其结果与前期研究的PhRCAα基因和PhTSJT1基因对冷胁迫的响应结果相似[5,6]。前人研究表明,当夜温在9 ℃以上时, 大部分蝴蝶兰的叶绿体和光合机构不会受到严重伤害,SOD活性呈现持续升高的趋势,植株转入正常生长温度下可得到恢复。而当夜温在6 ℃时,长时间的胁迫植株则会受到严重伤害,逐渐出现明显的冻斑、失绿等冷害症状[3],且转入正常生长温度下不能完全恢复[2]。在低温胁迫条件下PhCyP基因的转录表达与生理代谢变化的趋势一致。本研究分析发现,蝴蝶兰在不同低温胁迫下,众多因素参与对低温胁迫的响应和调控,并表现出不同的调控机制。短时间（4 h）的冷胁迫能够诱导PhCyP基因的表达启动其抗冷胁迫的调控。而当蝴蝶兰长时间受到冷胁迫后,由于光合机构的破坏及抗氧化酶系统的失活[2,3],最终导致植株不可逆的损伤。由于亲环素是一个蛋白家族,其种类与功能多样,蝴蝶兰其它的亲环素基因成员及功能的挖掘将会全面理解其在植物生理活动中的功能,并为进一步研究及应用奠定基础。