β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase, BGL）属纤维素水解酶系重要组成酶,可水解芳基或烃基与糖基间糖苷键生成葡萄糖与苷元[1]。大部分β-D-葡萄糖苷酶对底物糖基结构专一性较差,能水解C-S键、C-N键、C-F键等多种糖苷键。此外,有些对糖基C4和C2结构也不专一,能同时水解β-葡萄糖苷键和β-半乳糖苷糖。甚至,有些β-D-葡萄糖苷酶对C6位专一性也不高,也能水解木糖。因此,β-D-葡萄糖苷酶水解酶能适应多种底物[2]。
Bacillus属菌株分布广泛,菌落表面粗糙不透明,可利用蛋白质、多糖及淀粉,能分解色氨酸形成吲哚,在分子遗传操作中应用广泛。至今已从土壤中分离到B. subtilis、B. licheniformis、B. pumilus等多个种,并克隆及表达β-D-葡萄糖苷酶编码基因[3,4,5]。研究表明,香草兰发酵过程中Bacillus属菌株参与风味物质形成,水解香兰素葡萄糖苷的Bacillus属菌株β-D-葡萄糖苷酶在何种条件下发生催化,如何能达到最大催化效率,如何筛选高效产酶菌株,以便改进发酵方法提高香兰素产量。对分离菌株β-D-葡萄糖苷酶进行研究可为解决上述问题提供参考信息。选择本实验室分离到的2株菌株XY18和XY20进行β-D-葡萄糖苷酶编码基因全长克隆,采用E.coli进行表达,研究β-D-葡萄糖苷酶学性质。通过以上工作,了解2株菌株β-D-葡萄糖苷酶酶学特征。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株Bacillus siamensis XY18、Bacillus subtilis XY20均为中国热带农业科学院香料饮料研究所产品加工研究室保存。
1.2 方法
1.2.1 RACE扩增bgl全长 采用细菌基因组DNA抽提试剂盒（UNIQ-10,Sangon）提取基因组DNA。基于根据NCBI数据库基因同源性获得的菌株XY18及XY20 β-D-葡萄糖苷酶编码基因部分片段序列,设计引物,采用RACE技术扩增获得全长,扩增所采用的引物见表1。
表1 用于本研究的PCR引物Tab. 1 PCR primers used in this study |
| 引物Primer | 引物序列 (5'-3') Sequence of primer (5'-3') | 主要应用Main applicationa |
|---|---|---|
| RC128-1-F | GTYCTCCAYGCWCCGTTTACAG | XY18 APS |
| RC128-1-R | AASAGCGGYTTCTGATARCGGTC | XY18 APS |
| RC128-1-R2 | ACATACGGTGGATTACATCGGCTTCAG | XY18 CW |
| RC128-1-R1 | AAACACGATGTACCAAGCAGCCCAC | XY18 CW |
| RC128-1-F1 | TAGCTGAAGCCGATGTAATCCACCG | XY18 CW |
| RC128-1-F2 | CTGCTTGGTACATCGTGTTTTGCTTATTTT | XY18 CW |
| RC128-1-1F | TTGATACGGTMCGGCTGGATG | XY18 CW |
| RC128-1-1R | CTCCAGCCGCCGTAGTTTT | XY18 CW |
| RC128-2-F | GCTGGAAGAAYCGCAAAGTCATA | XY20 APS |
| RC128-2-R | ACAGCGGCTTCTGATARCGGT | XY20 APS |
| RC128-2-R2 | GCTTAGAAGTCATCGGATAGGTTGTCGTT | XY20 CW |
| RC128-2-R1 | GCTCTTCATCGCCTTCAGCCATTT | XY20 CW |
| RC128-2-F1 | AAAGCGGGTCACGACATCATTCCT | XY20 CW |
| RC128-2-F2 | TTGAAAGAACATACGGTGGATTACATTGG | XY20 CW |
| RC128-2-F2i | TGACAATAACGAAATGCAGGC | XY20 CW |
| GM- AP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC | XY18 CW, XY20 CW |
| GM- AP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT | XY18 CW, XY20 CW |
Note: a APS: Amplification partial sequence, CW: Chromosome walking. | |
注：a APS：扩增部分片段, CW：染色体步移。 |
1.2.2 质粒重组、融合蛋白表达及纯化 UCm-T载体的重组：目的DNA片段和载体连接采用PCR产物T/A pUCm-T克隆试剂盒（Sangon）进行。反应混合物置于0.5 mL Eppendorf管中16 ℃连接1 h。将重组pUCm-T载体及pET28a(+)/pET28b(+)进行酶切并连接,构建重组载体。菌株XY18使用pET28a(+),菌株XY20使用pET28b(+)。取1 μL重组的pET28b(+)质粒转化BL21菌株,42 ℃热击90 s,冰上静置2 min后涂平板（30 µg/mL卡那霉素）,37 ℃培养过夜。重组的pET28a(+)采用34 µg/mL氯霉素筛选。小试培养选择最佳的诱导条件后重组蛋白的大量诱导。超声破碎菌体后采用镍琼脂糖亲和层析纯化蛋白。
1.2.3 β-D-葡萄糖苷酶酶活的测定 酶的测定方法：取酶液10 μL,加入pH 6.5缓冲液80 μL,再加入50 mmol/L pNPG 10 μL,于37 ℃保温10 min。空白对照以100 ℃灭活2 min酶液代替。反应后,加入1 mol/L Na2CO3 100 μL显色,用酶标仪测405 nm处吸光度（OD405）。1个酶活力单位（U）定义为：pH 6.5、37 ℃条件下,每分钟生成1 μmol pNP所需的酶量。
1.2.4 pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性及稳定性的影响 pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性影响测定方法参照Michlmayr等[6]方法并略有改动。维持37 ℃恒定,在pH 4.0~9.0范围内以1.0幅度变化测定pH对酶活影响。维持pH 6.5恒定,在温度25~50 ℃范围内以5.0 ℃幅度变化测定温度对酶活影响。pH 6.5条件下,酶液置于30、40、50、60和70 ℃处理后再测定酶活力。pH 4.0~9.0范围内以1.0幅度变化处理酶液后再测定酶活力。
1.3 数据处理
采用DNAMAN 6.0构建质粒图谱,数据统计分析采用Excel 2010结合Origin 8.6软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 bgl基因全长获取
根据前期研究已获得的β-D-葡萄糖苷酶编码基因bgl部分片段的序列信息,设计引物,采用RACE技术进行染色体位移,扩增获得菌株XY18和XY20 β-D-葡萄糖苷酶编码基因全长,CDS区分别为1398和1410 bp。采用BLASTn进行比对,结果表明,菌株XY18 bgl序列与B. amyloliquefaciens的β-D-葡萄糖苷酶编码基因序列相似性为96%,而菌株XY20 bgl序列与B. subtilis的β-D-葡萄糖苷酶编码基因序列相似性为99%。其反映了获得的序列为Bacillus属菌株β-D-葡萄糖苷酶编码基因。
2.2 重组载体构建
质粒pET28b(+)与含目的片段（XY20）的重组pUCm-T载体经NdeI、XhoI限制性酶切并构建重组pET28b(+)/bgl表达载体,图1为重组载体pET28b(+)/bgl（以XY20为例）构建框架图。pET28a(+)与来源于XY18目的片段连接。
2.3 β-D-葡萄糖苷酶纯化
分别将含重组蛋白的E. coli BL21在20和37 ℃进行诱导表达,并以诱导前菌体沉淀作为对照。融合蛋白（54 kDa）在37 ℃诱导比20 ℃诱导条件下表达量高,因此,选择37 ℃诱导菌体上清。纯化后均获得SDS-PAGE水平上单一条带产物,为更进一步确认蛋白纯度与表达量,Western blot显色结果表明,融合蛋白得到大量表达并经纯化后获得单一蛋白产物（图2）。
图2 β-D-葡萄糖苷酶纯化检测M：Marker;1、2、3、4：β-D-葡萄糖苷酶;A：SDS-PAGE电泳检测（XY18）;B：SDS-PAGE电泳检测（XY20）;C：Western-blot检测（XY18）;D：Western-blot检测（XY20）。 Fig. 2 Purification of β-D-glucosidase M: Marker; 1, 2, 3, 4: β-D-glucosidase; A: SDS-PAGE analysis (XY18); B: SDS-PAGE analysis (XY20); C: Western-blot analysis (XY18); D: Western-blot analysis (XY20). |
2.4 pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性的影响
以最高酶活100%来衡量pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活力影响。如图3所示,以pH4.0为起点,随着pH增加,酶活性增加,在pH6.0时酶活性最大;随着pH进一步增加,酶活性逐渐降低。以温度25 ℃为起点,随着温度增加,酶活性增加,直至40 ℃时酶活性最大,然而温度进一步增加后,酶活性迅速降低。
2.5 pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶稳定性的影响
3 讨论
决定香草兰品质最重要因素之一为香兰素含量,而香草兰发酵目的在于让豆荚中香兰素葡萄糖苷接触β-D-葡萄糖苷酶从而水解产生香兰素[7]。对香草兰β-D-葡萄糖苷酶进行纯化发现,该酶分子量为201 kDa,由大小相同的4个亚基组成,最适pH为6.5,最适宜温度为40 ℃[8]。内源β-D-葡萄糖苷酶对香兰素生成的贡献至今仍存在争议。Odoux[9]研究发现,根据香草兰发酵后生成香兰素含量来衡量,在发酵过程中内源β-D-葡萄糖苷酶仅有效利用其催化活性40%,大部分活性都在其发酵过程中丢失。该课题组进一步研究香兰素葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷酶活及细胞组织破裂间关系,他们又提出虽然β-D-葡萄糖苷酶酶活在发酵过程中发生失活,但香兰素葡萄糖苷转化完全。因此认为,β-D-葡萄糖苷酶并未影响香兰素葡萄糖苷的水解程度,只影响其水解速率快慢[10]。本课题组研究已证实,内源β-D-葡萄糖苷酶在发酵过程中并未完全参与香兰素葡萄糖苷水解,在杀青24 h后发生失活,而后续香兰素葡萄糖苷水解则由外源Bacillus β-D-葡萄糖苷酶来完成,因此,对外源Bacillus菌株β-D-葡萄糖苷酶了解,有助于探讨香兰素葡萄糖苷水解机制及改进发酵工艺。
β-D-葡萄糖苷酶是一种常见水解酶,之前研究已从Bacillus polymyxa、Aureobasidium pullulans、Bacillus circulans subsp. alkalophilus、Thermobifida fusca分离到产β-D-葡萄糖苷酶菌株,这些菌株都具有较强耐热能力,但由于Bacillus属菌株在参与发酵过程中产生其他异味,且来源于非食品环境,是否可用于发酵尚有待研究[11,12,13,14]。菌株XY18、XY20所产β-D-葡萄糖苷酶显示一定耐热能力,说明在发汗、干燥阶段即使环境温度较高,菌株均能存活且起到水解香兰素葡萄糖苷作用。此外,在接近中性环境条件下,酶活力较高,也为提高催化活性所需环境条件提供参考。