菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）为桑科（Moraceae）,是热带地区典型常绿树种之一[1]。千年之前被引入中国,主要栽培在我国海南、广东、广西、云南和四川南部的热带、亚热带地区以及南亚热带地区[2]。菠萝蜜是世界上最大的可食用水果,由外皮、黄色果肉、鳞茎和种子组成。种子占果实总重的8%~15%[1],富含大量淀粉,占干物质的60%~80%[3]。菠萝蜜种子淀粉（jackfruit seed starch,JFSS）的研究利用仍处于初级阶段,虽对JFSS的性质进行了研究,验证了其在食品和其他用途中的适用性[4],但JFSS的分子结构还需进一步研究。
淀粉分子结构一直是食品科研人员的研究重点,主要包括淀粉精细结构,支链链长分布是最普遍的精细结构分析之一[5]。目前有关JFSS分子结构报道较少,Zhang等[1]报道了JFSS直链和支链淀粉平均分子量,表明分子大小随直链和支链淀粉平均分子量增加而增加。Zhang等[1]研究了普鲁兰酶脱支菠萝蜜种子支链淀粉（debranched jackfruit seed amylopectin,DAP）,发现高比例A链可形成致密结构,高比例B2和B3链与平均链长相关。Luciano等[6]选取异淀粉酶脱支JFSS（debranched JFSS,DS）,发现软JFSS的A链比例低于硬JFSS,B1、B2、B3链和平均链长高于硬JFSS。目前,DS和DAP的平均分子量尚未见报道,JFSS链长分布虽存在少量研究,但淀粉脱支酶的选择却不统一,对淀粉或支链淀粉进行水解也存在不一致性。
本研究中,以JFSS及支链淀粉作为原料,通过高性能体积排阻色谱-多角度激光散射检测器-示差折光检测器（high-performance size exclusion chromatography-multi-angle laser light-scattering detector-refractive index detector,HPSEC-MALLS- RI）联用系统分析DS和DAP分子量特征,采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器（high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD）确定DS和DAP链长分布,并且利用快速黏度分析仪（rapid visco analyzer,RVA）测定DS和DAP糊化特性,以确定不同淀粉脱支酶对DS和DAP分子结构和糊化特性的影响,为JFSS的进一步研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料与试剂 菠萝蜜种子由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供,为马来西亚引进品种。普鲁兰酶,美国Sigma公司;异淀粉酶,爱尔兰Megazyme公司;二甲基亚砜（色谱纯）,德国Meker公司;葡聚糖标准品T40,美国Sigma公司;醋酸钠（色谱纯）,美国Dionex公司;氢氧化钠（色谱纯）,德国Meker公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备 HPSEC-MALLS-RI高效液相色谱系统（配有多角度激光光散射检测器、示差折光检测器及Astra 5.3.4数据处理系统）：美国Waters公司;HPAEC-PAD高效液相阴离子色谱系统（配有脉冲安培检测器及Chromeleon 6.8色谱工作站）：美国Dionex公司;TechMaster快速黏度分析仪：瑞典perten仪器公司;LXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂;Scientz-18ND冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司;SHZ-C水浴恒温振荡器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Blue pard电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司;SY-100C脱壳机：台州市鲨鱼食品机械有限公司;HX-PB908多功能磨浆机：佛山市海迅电器有限公司;80胶体磨：上海科劳机械厂。
1.2 方法
1.2.1 制备菠萝蜜种子淀粉 种子置于50 ℃干燥箱,外壳略干、内种衣湿润时取出并去除。种仁加蒸馏水于磨浆机粉碎,粗浆与蒸馏水1∶3混合,胶体磨细磨5 min。过200目筛后水洗,5000 r/min离心10 min,沉淀与0.5 mol/L硫代硫酸钠1∶1混合搅拌36 h。再次离心,刮去沉淀上层褐色皮并水洗,用1.0 mol/L盐酸中和至pH 7.0,离心,沉淀用50%无水乙醇洗涤。所得JFSS于50 ℃冷冻干燥至水分含量<13%[3]。
1.2.2 分离菠萝蜜种子支链淀粉 JFSS加蒸馏水配成质量分数3%的溶液,于100 ℃水浴摇床1 h。5000 r/min离心10 min,沉淀加蒸馏水配成质量分数3%的溶液,于100 ℃水浴摇床1 h,再次离心去除残留直链淀粉,沉淀加甲醇配制成质量分数80%的溶液,涡旋2 min,离心,沉淀为支链淀粉。所得支链淀粉于50 ℃冷冻干燥至水分含量<13%[1]。
1.2.3 测定分子量分布 JFSS或支链淀粉22.5 mg分别溶于二甲基亚砜溶液0.3 mL（色谱纯）,100 ℃加热10 min后沸水浴10 min。冷却后,加1.5 mL醋酸钠缓冲溶液（1.0 mol/L,pH 4.0）,5 μL普鲁兰酶或异淀粉酶（1000 U/mL）,40 ℃水浴24 h脱支,取出后沸水浴灭酶20 min。DS和DAP以12 000 r/min离心10 min,上清液过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜[7]。
流动相：50 mmol/L硝酸钠-二甲基亚砜,超声20 min;流速：0.6 mL/min;色谱柱：Styragel HMW 6E DMF和HMW 2 MF串联;柱温：45 ℃;RI检测器：40 ℃;进样量：100 μL。葡聚糖标准品：T40,2 mg/mL,用于MALLS中检测器归一化[7]。采用Astra 5.3.4软件采集分析光散射数据和示差检测器信号。曲线拟合用采二阶Berry模型,计算重均分子量（weight average molecular weight,Mw）、数均分子量（number average molecular weight,Mn）、平均旋转半径（average radius of gyration,Rg）和多分散性（polydispersit
-yindices,PI）[7]。
1.2.4 测定支链淀粉精细结构 JFSS或支链淀粉40 mg,加2 mL醋酸钠缓冲溶液（50 mmol/L,pH 6.0）,沸水浴30 min,55 ℃水浴10 min,加5 μL普鲁兰酶或异淀粉酶（1000 U/mL）,55 ℃水浴24 h,沸水浴灭酶20 min,冷却后12 000 r/min离心10 min,取上清液,过0.45 μm水系滤膜,稀释10倍进样[1]。
流动相：屈臣氏蒸馏水（A）,0.25 mol/L氢氧化钠（B）,0.1 mol/L氢氧化钠+1 mol/L醋酸钠（C）;流速：0.5 mL/min;色谱柱：Cabo Pac PA20（3 mm× 150 mm）分析柱和Carbo Pac PA20（3 mm×30 mm）保护柱;柱温：30 ℃;进样量：10 μL;脉冲积分安培检测：Au工作电极,Ag/AgCl参比电极,检测电位波形为标准四电位波形[1]。采用峰值分析软件确定A、B1、B2和B3链聚合度所占比例[8]。1.2.5 测定糊化特性 JFSS或支链淀粉3.0 g与25 mL蒸馏水混合,在RVA容器中960 r/min搅拌10 s,然后以160 r/min进行剩余程序。50 ℃保持1 min后,以6 ℃/min加热至95 ℃并保持5 min,以6 ℃/min冷却至50 ℃并保持2 min。记录糊化参数峰值黏度、最低黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度[3]。
1.3 数据处理
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析,p<0.05为显著;采用Origin 8.5软件绘图。
2 结果与分析
2.1 分子量分布
图1 MALLS分析普鲁兰酶DS（A）及DAP（B）的洗脱曲线Fig. 1 Elution curves produced from MALLS analysis of pullulanase DS (A) and DAP (B) |
图2 MALLS分析异淀粉酶DS（A）及DAP（B）的洗脱曲线Fig. 2 Elution curves produced from MALLS analysis of isoamylase DS (A) and DAP (B) |
表1 DS及DAP的重均分子量、数均分子量、平均旋转半径和多分散性Tab. 1 Weight-average molecular weights, number-average molecular weights, average radius of gyration values and polydispersity indices of DS and DAP |
| 分子特征 Molecular characteristic | 重均分子量 Weight-average molecular weight/(106 g·mol-1) | 数均分子量 Number-average molecular weight/(106 g·mol-1) | 平均旋转半径 Average radius of gyration/nm | 多分散性 Polydispersity index |
|---|---|---|---|---|
| 普鲁兰酶DS | 3.66b | 1.95b | 95.5ab | 1.9a |
| 普鲁兰酶DAP | 2.37d | 1.24c | 80.7c | 1.9a |
| 异淀粉酶DS | 4.41a | 2.94a | 99.4a | 1.5b |
| 异淀粉酶DAP | 3.27c | 1.86b | 86.9b | 1.8a |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (p<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。 |
2.2 支链淀粉分支链长分布
图3 普鲁兰酶DS（A）及DAP（B）的分支链长分布Fig. 3 Branch chain length distribution of pullulanase DS (A) and DAP (B) |
图4 异淀粉酶DS（A）及DAP（B）的分支链长分布Fig. 4 Branch chain length distribution of isoamylase DS (A) and DAP (B) |
表2 DS及DAP的分支链长分布Tab. 2 Branch chain length distributions of DS and DAP |
| 链长分布 Chain length distribution/% | A链 A chain (DP 2~12) | A链 A chain (DP 6~12) | B1链 B1 chain (DP 13~24) | B2链 B2 chain (DP 25~36) | B3链 B3 chain (DP≥37) | 平均链长 Average chain length (DP) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 普鲁兰酶DS | 44.18a | — | 39.63a | 13.26c | 2.93b | 17.02b |
| 普鲁兰酶DAP | 41.24b | — | 38.95ab | 16.63b | 3.18b | 17.93b |
| 异淀粉酶DS | — | 40.95b | 38.84ab | 16.97b | 3.24a | 18.27a |
| 异淀粉酶DAP | — | 39.84c | 37.95b | 18.94a | 3.27a | 18.66a |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (p<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。 |
2.3 糊化特性
DS和DAP的糊化参数如表3所示。DS和DAP的糊化特性观察到显著差异（p<0.05）。DS和DAP的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度分别为156~338 cP、105~ 236 cP、50~102 cP、424~689 cP、120~234 cP和50.15~62.47 ℃。
表3 DS及DAP的糊化特性Tab. 3 Pasting properties of DS and DAP |
| 参数Parameter | 峰值黏度 Peak viscosity/cP | 谷值黏度Trough viscosity/cP | 崩解值 Breakdown/cP | 最终黏度 Final viscosity/cP | 回生值 Setback/cP | 糊化温度 Pasting temperature/℃ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 普鲁兰酶DS | 338a | 236a | 102a | 689a | 234a | 50.15d |
| 普鲁兰酶DAP | 296b | 213ab | 83b | 577b | 183b | 53.62c |
| 异淀粉酶DS | 224c | 160b | 64c | 570b | 174bc | 58.69b |
| 异淀粉酶DAP | 156d | 105c | 50cd | 424c | 120c | 62.47a |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (p<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。 |
3 讨论
DS的Mw、Mn和Rg均高于DAP的Mw、Mn和Rg。Cai等[12]的研究表明,蜡质淀粉产生的线性直链分子具有较窄的分子量分布,含直链的淀粉（如普通淀粉和高直链淀粉）产生的线性直链分子具有较宽的分子量分布。普鲁兰酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg均低于异淀粉酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg,这是由于普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键完全,导致分子量明显下降[13]。普鲁兰酶能专一性切开支链淀粉分支点中α-1,6糖苷键,将最小单位的支链分解,使水解产物中含有更多游离线性直链淀粉分子,最大限度利用淀粉原料[14];而异淀粉酶虽然也能水解糖原或支链淀粉分枝点的α-1,6糖苷链,形成长短不一的线性直链淀粉分子,但是却不能水解由2~3个葡萄糖残基构成的侧枝[10]。Zhang等[15]的研究表明,JFSS的Mw、Mn、Rg和PI分别是1.74×107~4.61× 107 g/mol、1.10×107~2.34×107 g/mol、115.4~144.2 nm和1.4~ 2.0。Zhang等[1]报道,JFSS支链淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分别为2.51×107~6.74×107 g/mol、1.87×107~5.36×107 g/mol、94.6~136.5 nm和1.21~ 1.41。对比前人研究结果,DS和DAP平均分子量较正常JFSS及支链淀粉平均分子量明显降低,是由于普鲁兰酶和异淀粉酶通过水解α-1,6糖苷键,导致其形成低分子量的线性直链分子[16,17]。普鲁兰酶脱支甘薯淀粉的Mw、Mn和PI分别是3.07×107~3.09×107 g/mol、2.81×105~3.00×105 g/mol和10.31~10.92[18],普鲁兰酶脱支蜡质大米淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分别是3.19×105 g/mol、6.12×104 g/mol、22.80 nm和5.33[19],异淀粉酶脱支马铃薯、小麦、玉米和蜡质玉米淀粉的Mw和Rg范围是2.5×104~3×105 g/mol和5~20 nm[20]。对比前人研究结果,普鲁兰酶DS的Mw、Mn和PI低于普鲁兰酶脱支甘薯淀粉;普鲁兰酶DAP的Mw、Mn和Rg高于普鲁兰酶脱支蜡质大米,但PI低于普鲁兰酶脱支蜡质大米;异淀粉酶DS和DAP的Mw和Rg高于异淀粉酶脱支马铃薯、小麦、玉米和蜡质玉米淀粉。不同植物来源、种植环境和淀粉组成均能导致平均分子量显著不同[21]。
DS的A链和B1链高于DAP,但B2链和B3链低于DAP,可能是由于JFSS中含直链淀粉,DS产生线性直链淀粉分子与JFSS中原有直链淀粉结合,因此与DAP存在差异。Tester等[22]报道了淀粉中直链/支链淀粉组成强烈影响其对酶水解的敏感性。普鲁兰酶DS和DAP的A链和B1链分别高于异淀粉酶DS和DAP的A链和B1链,是由于普鲁兰酶水解反应对于较短的侧链更有效[11],水解后短链含量明显增加[23]。普鲁兰酶DS和DAP的B2链和B3链分别低于异淀粉酶DS和DAP的B2链和B3链,是由于普鲁兰酶难以切割更长侧链,水解长链相对困难[11]。因此,不同淀粉脱支酶和不同直链/支链淀粉组成均能导致链长分布显著不同。异淀粉酶DAP平均链长最长,普鲁兰酶DS平均链长最短,Zhang等[1]报道最长的平均链长与高比例的B2链和B3链直接相关。大米淀粉A链、B1链、B2链、B3链和平均链长范围是17.3%~19.4%、57.4%~58.9%、12.7% ~14.0%、10.0%~10.9%和DP 20.6~21.2[24]。蜡质玉米A链、B1链、B2链、B3链和平均链长范围是37.27%、38.79%、11.49%、12.46%和DP 19.65[25]。对比前人研究结果,大米淀粉A链和B2链小于DS,B1链、B3链和平均链长大于DS;蜡质玉米的A链、B1链和B2链小于脱支DAP,B3链和平均链长大于DAP。不同的植物来源、淀粉组成、水解条件等均会造成上述差异[25,26]。
峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度和回生值均表现为异淀粉酶DAP最低,普鲁兰酶DS最高,但糊化温度表现出相反结果。可能是由于异淀粉酶DAP具有高比例B2链、B3链和最长平均链长,而普鲁兰酶DS具有低比例B2链、B3链和最短平均链长。Zortéa-Guidolin等[27]发现,高比例B2链、B3链以及最长平均链长可导致淀粉糊化特性降低。Jane等[28]表明,糊化温度与高比例B2链、B3链和最长平均链长正相关。异淀粉酶DAP崩解值最低,表明其具有较高抗剪切性,淀粉颗粒具有较强凝聚力和较高热稳定性[27]。普鲁兰酶DS回生值最高,说明其具有较高老化趋势。JFSS峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度分别为2539~3233 cP、2252~2365 cP、174~ 981 cP、3001~4230 cP、749~1865 cP和80.15~ 91.29 ℃[3]。蜡质马铃薯淀粉峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度分别为3570 cP、1196 cP、2374 cP、1573 cP、377 cP和71.9 ℃[29]。对比前人研究结果,DS和DAP峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度均低于JFSS和蜡质马铃薯淀粉,说明酶解能够降低淀粉糊化特性,对淀粉糊化特性造成显著影响。
4 结论
采用普鲁兰酶和异淀粉酶对JFSS及支链淀粉进行脱支处理,分析2种脱支酶对其分子结构和糊化特性的影响。DS和DAP的平均分子量、链长分布和糊化特性均存在显著差异（p<0.05）。DS和DAP的平均分子量显著降低。JFSS中含直链淀粉,所以DS平均分子量高于DAP,DS短链比例高于DAP,长链比例低于DAP。普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键更完全,所以普鲁兰酶DS和DAP平均分子量较异淀粉酶DS和DAP平均分子量下降更明显。普鲁兰酶可以水解更短的侧链,所以普鲁兰酶DS和DAP短链比例高于异淀粉酶DS和DAP。但普鲁兰酶难以切割较长的侧链,异淀粉酶则可以水解外分支链,所以普鲁兰酶DS和DAP长链比例低于异淀粉酶DS和DAP。异淀粉酶DAP具有高比例B2链、B3链和长平均链长,导致其峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度和回生值较低,但糊化温度高。本研究结果表明,不同淀粉脱支酶和不同直链/支链淀粉组成均能造成分子结构和糊化特性的显著差异,本研究为进一步分析JFSS分子结构和糊化特性提供了依据。