杂草稻（Oryza sativa f. spontanea）是广泛分布在世界各地稻田中的一种不断自生的恶性杂草,最早于1846年在美国发现。杂草稻早熟、易落粒、多数具有红色果皮,在田间与栽培稻相伴而生,与栽培稻竞争光、水分和营养,外形上与栽培稻极难区分,难以防治。我国有25个省均有不同程度的杂草稻发生。近年来,随着直播稻等水稻简化栽培技术的推广,我国江苏、湖南、广东、辽宁等省的杂草稻发生越来越重,严重影响水稻产量和质量。雷州市是广东西部地区的重要水稻生产基地,但自20世纪90年代初起,杂草稻逐渐成为雷州市直播稻区的主要草害,严重危害雷州地区水稻的生产[1]。
杂草稻种子的落粒性是其能在稻田中不断自我繁衍从而导致水稻减产的主要原因。谷粒从小穗轴上的脱落是由离层控制的,离层区是木本双子叶植物及裸子植物落叶前,叶柄或叶基部所形成离区的部分细胞层。花梗、果枝上也常有离层发生,造成落花、落果。研究表明,水稻的落粒性是由少数主效基因和多个微效基因共同控制的数量性状。近年来报道的落粒相关基因有很多,如sh4[2]、qSH1[3]、sh5[4]、SHAT1[5]、CPL1[6]、SNB[7]、sh1[8]等。目前认为,sh4和qSH1是控制水稻落粒性状的主效基因。2006年,Li等[2]在水稻第4染色体发现了1个贡献率为69%的主效QTL位点,命名为sh4,该基因编码与Myb3同源的转录因子,其第1个外显子中的第237个核苷酸的替换（G→T）导致了1个氨基酸的替换（赖氨酸→天冬酰氨）,使表型从易落粒变成了难落粒。该基因的功效十分明显：具有野生稻等位基因（G）的水稻,谷粒成熟后自然脱落,或者轻打就能脱落,而栽培稻等位基因（T）的水稻,则需要外力才能使谷粒脱落。同年,Konishi等[3]发现了一个对Nipponbare × Kasalath的杂交F2代的落粒性贡献率为68.6%的主效基因qSH1,其编码BEL1型同源基因,qSH1基因上游12 kb的调控区有一个核苷酸的替换（G→T）,引起该基因功能的改变,导致落粒性的降低。
雷州主要水稻产区多为直播和机械收割,且雷州杂草稻的落粒性极高,种子扩散速度快、范围广,难以防治。本研究以雷州市10个杂草稻危害严重区域为研究对象,对杂草稻的sh4和qSH1基因的功能SNP位点进行了PCR扩增及测序分析,确定了雷州市这10个杂草稻群体的sh4和qSH1的落粒基因型,为研究雷州市杂草稻的落粒机制及起源方式提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料采集 2018年11月从广东湛江雷州市杂草稻发生严重的10块稻田中采集杂草稻种子,采集时主要通过落粒性、颖壳颜色及果皮颜色或三者结合来判断是否为杂草稻。每个稻田采集10个单株,每株取单穗,共100份杂草稻种子,同时采集了对应稻田的栽培稻（籼稻）1个单穗,共10份栽培稻种子。杂草稻及对应栽培稻的采样地点信息见表1。
表1 雷州杂草稻及对应栽培稻采集地点Tab. 1 Sampling sites of weedy rice and corresponding cultivated rice in Leizhou |
| 群体编号 Population number | 经度 Longitude | 纬度 Latitude | 地点 Location |
|---|---|---|---|
| 1 | 110°15°E | 20°40°N | 调风镇 |
| 2 | 110°11°E | 20°48°N | 雷高镇 |
| 3 | 110°05°E | 20°49°N | 雷高镇 |
| 4 | 110°07°E | 20°46°N | 南兴镇 |
| 5 | 110°03°E | 20°46°N | 南兴镇 |
| 6 | 110°05°E | 20°49°N | 南兴镇 |
| 7 | 109°46°E | 20°52°N | 唐家镇 |
| 8 | 109°55°E | 20°50°N | 唐家镇 |
| 9 | 110°01°E | 20°52°N | 松竹镇 |
| 10 | 109°58°E | 20°56°N | 北和镇 |
1.1.2 试剂 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase购自TaKaRa公司,植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 杂草稻种子性状观测 观测100份杂草稻单穗的主要性状,包括颖壳颜色、果皮颜色、芒和落粒率。落粒率的测定方法为：将穗于2 m高处自由落下,统计脱落粒数和未脱落粒数,空壳不计数,落粒率=(即落粒数/总粒数)×100%。
1.2.2 DNA提取 由于杂草稻有一定的异交率,种子的基因型可能与母本的基因型不一致,因此,本研究中,每份杂草稻及对应的栽培稻都取颖壳用于DNA提取。将6~10粒种子剥下颖壳,用液氮研磨后,采用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,获得的DNA于-20 ℃保存备用。
表2 引物序列Tab. 2 Primers used in this study |
| 基因 Gene | 引物 Primer | 序列 Sequence | 片段大小 Fragment size/bp |
|---|---|---|---|
| sh4 | sh4-F | 5°-ACCAAACGCCTCAGCTTGCCTT-3° | 529 |
| sh4-R | 5°-TAGTCGCGGACCTTCTTGTAGT-3° | ||
| qSH1 | qSH1-TK-F | 5°-GTAACCTTTCCTGGCACAGC-3° | 510 |
| qSH1-TK-R | 5°-GCGGTAGCACACTAGCATGA-3° |
PCR扩增使用PrimeSTAR® Max DNA Polymerase,25 μL的反应体系包括：灭菌双蒸水9.5 μL,PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL,引物（10 μmol/L）各1 μL,模板DNA 1 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35 cycle;72 ℃延伸7 min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳检测后,送公司测序。将测序结果与日本晴的sh4和qSH1上游调控区序列进行比对分析,使用的DNA序列比对软件为DNAMAN。
2 结果与分析
2.1 种子主要性状观测
对雷州的这10个群体的100份杂草稻种子的主要性状进行了观测,发现这些杂草稻种子的颖壳颜色有黑褐色、黄色和黄色带褐斑,果皮颜色有红色、浅红色和白色,有些有芒,有些无芒,落粒率也有高有低（图1）。虽然雷州的杂草稻和栽培稻相比均具有较高的落粒性,但落粒率有较大差异。本研究根据落粒率的大小将雷州杂草稻的落粒性分为3个等级：低（落粒率<30%）、中（30%≤落粒率≤75%）、高（落粒率>75%）。其中,落粒性高的有77份,落粒性中等的有19份,落粒性低的有4份。雷州的杂草稻中有黑壳红皮、黑壳白皮、黄壳红皮、黄壳白皮等各种不同的表型,落粒性差异也较大,可能因为杂草稻有一定的异交率,伴生于栽培稻,与栽培稻有广泛的基因交流,使得雷州的杂草稻表型丰富多样。对应的10份栽培稻种子的颖壳颜色均为黄色,果皮颜色均为白色,落粒性中等的有2份,落粒性低的有8份。杂草稻种子的种子落粒性状见表3。
图1 雷州采集的杂草稻A：高落粒性的杂草稻;B：中落粒性的杂草稻;C：低落粒性的杂草稻;D：栽培稻。 Fig. 1 Weedy rice collected from Leizhou A: Weedy rice with high seed shattering; B: Weedy rice with moderate seed shattering; C: Weedy rice with low seed shattering; D: Cultivated rice. |
表3 雷州杂草稻的种子落粒性和相应SNP单倍型Tab. 3 Seed shattering characteristics and SNP haplotypes of weedy rice in Leizhou |
| 杂草稻数量 Number of weedy rice | 落粒率 Seed shattering rate | SNP (sh4) | SNP (qSH1) | SNP2 (qSH1) | SNP3 (qSH1) |
|---|---|---|---|---|---|
| 48 | 高 | G | G | A | G |
| 12 | 高 | G/T | G | A | G |
| 4 | 高 | T | G | A | G |
| 17 | 中 | ||||
| 3 | 低 | ||||
| 7 | 高 | G | G | G | T |
| 3 | 高 | G/T | G | G | T |
| 1 | 高 | T | G | G | T |
| 2 | 中 | ||||
| 1 | 低 | ||||
| 2 | 高 | G | G | G | G |
Note: SNP2 is 147 bp downstream of SNP (qSH1), SNP3 is 151 bp downstream of SNP (qSH1). | |
注：SNP2为SNP（qSH1）下游147 bp处,SNP3为SNP（qSH1）下游151 bp处。 |
2.2 sh4功能SNP位点的序列分析
PCR产物经电泳、回收后送公司测序,得到500 bp左右的核苷酸碱基片段序列。将100份杂草稻和10份栽培稻的sh4序列与日本晴的sh4序列进行比对发现,57份杂草稻在功能SNP位点处为G（野生落粒型）,28份杂草稻为T（突变难落粒型）,还有15份杂草稻为杂合型G/T;10份栽培稻的sh4的SNP位点均为T（图2,表3）。对照这100份杂草稻的sh4基因型与其落粒率发现,基因型为G的57份杂草稻和基因型为G/T的15份杂草稻的落粒性都非常高（>95%）;而基因型为T的杂草稻的落粒性则有高有低,从16%~ 100%,其中有5份杂草稻的落粒率很高（>95%）,有19份杂草稻的落粒率介于30%~75%,有4份杂草稻的落粒率较低,小于30%。
2.3 qSH1上游调控区功能SNP位点的序列分析
PCR产物经电泳、回收后送公司测序,得到500 bp左右的核苷酸碱基片段序列。将100份杂草稻和10份栽培稻的qSH1上游调控序列与日本晴的序列进行比对,结果发现,100份杂草稻和10份栽培稻的qSH1上游调控序列的SNP位点均为G（表3）,与籼稻的基因型一致,为易落粒型,说明这100份杂草稻之间及其与对应栽培稻的落粒性差异与qSH1上游调控序列的SNP位点无关,这些杂草稻的极高落粒性可能不是qSH1基因的作用。另外,有15份杂草稻和3份栽培稻在此SNP位点下游147 bp处还有一个突变（G）,而日本晴中为A,这15份中又有13份杂草稻在此SNP位点下游151 bp处还有另一个突变（T）,而日本晴中为G。
3 讨论
3.1 雷州杂草稻落粒性与qSH1基因型的关系
近几年,有研究人员对我国杂草稻危害严重地区的杂草稻的qSH1基因功能SNP位点进行了测序分析,如王黎明等[10]发现雷州地区的6份杂草稻的qSH1基因上游调控序列的功能SNP位点均为G,其中有2份杂草稻在该SNP位点下游147 bp处存在1个突变位点（G）,而日本晴中为A。王军等[11]研究发现江苏省和东北三省的33份杂草稻的qSH1基因的功能SNP位点也均为G,有3份杂草稻在该SNP位点下游147 bp处存在1个突变位点（G）。本研究中,雷州的100份杂草稻的qSH1功能SNP位点也均为G,与王黎明等在雷州杂草稻和王军等在江苏省和东北三省杂草稻中鉴定的结果一致。同时,雷州这100份杂草稻与对应稻田的10份栽培稻的qSH1基因的功能SNP位点也一致,然而,杂草稻之间及杂草稻与栽培稻之间的落粒性差异很大,说明雷州杂草稻极高的落粒性不是qSH1基因起主要作用。此外,本研究中,15份杂草稻和3份栽培稻中也有王黎明等和王军等发现的功能SNP位点下游147 bp处的另一个碱基突变,但是,其中有13份杂草稻还在功能SNP位点下游151 bp处存在一个碱基突变。18份在功能SNP位点下游有1或2个突变位点的杂草稻和栽培稻与其落粒性并无规律,无法判断这2个突变位点是否与杂草稻的落粒性相关。
3.2 雷州杂草稻落粒性与sh4基因型的关系
目前,国内外都有对杂草稻sh4基因型的研究。如,Thurber等[12]发现,美国杂草稻sh4基因的功能SNP位点处均为T,为难落粒基因型。Zhu等[13]分析发现,亚洲杂草稻在sh4基因的功能SNP位点处均为T,说明sh4在亚洲水稻的驯化过程中所起的作用并不大。王军等[11]研究发现,江苏省和东北三省的33份杂草稻在sh4基因功能SNP位点处均为T,说明33份杂草稻的落粒性与sh4基因无关。以上研究中,采集的杂草稻的sh4基因的功能SNP位点均为T,为突变难落粒基因型,表明这些杂草稻的落粒性与sh4基因无关。但本研究中,雷州的100份杂草稻中,sh4基因的功能SNP位点存在3种类型（G、T和G/T）,其中大部分都是G或G/T型,只有小部分是T型。杂合型G/T的杂草稻可能为杂草稻之间或杂草稻与栽培稻之间的杂交后代。这与前人的研究结果不同,说明不同地区的杂草稻存在不同的落粒机制。对照这100份杂草稻的落粒表型和sh4的SNP基因型,发现57份G型和15份G/T型的杂草稻的落粒性都很高（>95%）,推测sh4可能对这些杂草稻的落粒表型起到重要的作用,同时sh4（G）引起的落粒表型为显性,这与Li等[2]的研究结论一致。而28份T型杂草稻中,也有高、中等落粒和低落粒的差异,与同为T型的栽培稻的落粒性差异也很大,说明可能有其他基因对落粒性也有着重要的贡献,或者,落粒性高的杂草稻的sh4基因可能有其他位点的突变,具体原因还需进一步的研究。
3.3 雷州杂草稻的起源分析
目前,有关杂草稻的起源还没有定论,推测可能有以下几个途径[14]：（1）野生稻入侵稻田并适应稻田环境逐渐形成了杂草稻;（2）野生稻和栽培稻之间渐渗杂交逐渐形成杂草稻;（3）栽培稻品种之间杂交后代分离或回复突变产生落粒性等野生性状,逐渐适应并进化形成杂草稻。简化来说,杂草稻的起源可分为两类,一类是野生稻起源,包括上述的第一种和第二种假说;另一类是栽培稻起源,包括上述的第三种假说。
我国多个省份都有野生稻的自然分布,因此,我国杂草稻的起源方式可能较为复杂。不同地区的杂草稻很可能是分散起源的,是多样起源而非单一的。近些年,我国学者对杂草稻的起源进行了一些研究。邵菁等[15]利用SSR标记发现,江苏省杂草稻可能主要来自栽培稻的基因重组或回复突变即返祖遗传。马殿荣等[16]利用SSR标记发现,吉林省杂草稻与当地粳型栽培稻亲缘关系较近,很可能起源于当地粳型栽培稻。Qiu等[17]通过对江苏的3个杂草稻进行全基因组重测序认为,江苏的杂草稻起源于籼梗杂交。Qiu等[18]对155份杂草稻材料和76份当地历年栽培稻品进行了全基因组重测序群体分析发现,我国杂草稻均起源于栽培稻。以上研究都相对支持我国一些地区的杂草稻起源于栽培稻的假说。而Sun等[19]应用生物大数据分析方法,发现亚洲高纬度地区的杂草稻起源于栽培稻的遗传改良阶段,即处于半驯化状态。
雷州杂草稻的表型丰富多样,是研究杂草稻起源的宝贵材料。本研究中,雷州10个群体的杂草稻的sh4基因的功能SNP位点有3种类型：野生落粒型（G）、突变不落粒型（T）和杂合型G/T。这是首次发现杂草稻的sh4基因型为野生型和杂合型。广东有多个市县均有野生稻分布,雷州也有5个野生稻分布点[20]。因此,雷州杂草稻的G/T型sh4基因可能有几个来源：（1）野生稻和栽培稻的异交,后代再分离又出现G型和T型杂草稻;（2）G型和T型杂草稻的异交;（3）G型杂草稻与栽培稻间的异交。野生型的sh4基因有可能来源于当地的野生稻,突变型的sh4基因可能来源于当地的栽培稻,同时也都可能来源于G/T型杂草稻后代的分离。因此,根据sh4基因型,推测雷州杂草稻可能有2种起源方式：野生型和杂合型sh4基因的杂草稻可能起源于野生稻,可能是野生稻入侵农田,或野生稻与栽培稻的杂交后代,或者野生稻的基因渐渗;而突变型的sh4基因的杂草稻可能起源于栽培稻的去驯化或杂交后代的分离。雷州杂草稻的起源方式还有待进一步进行基因组水平的序列分析研究。
4 结论
本研究对雷州10个杂草稻群体100个单株的杂草稻种子和对应的10份栽培稻种子的主要性状（颖壳颜色、果皮颜色、芒及落粒率）进行了观测,并对水稻落粒主效基因sh4和qSH1的功能SNP位点进行了序列分析。结果表明,雷州杂草稻种子的表型丰富多样,大部分杂草稻的落粒率极高。sh4基因的功能SNP位点的序列分析发现,100份杂草稻中,有57份杂草稻的sh4功能SNP位点为野生落粒型（G）,15份为杂合型G/T,28份为突变难落粒型（T）。其中,G和G/T型的杂草稻的落粒率都极高,接近100%,而T型杂草稻大都为中度及低度落粒,少数几个也表现为极高的落粒率。qSH1基因的功能SNP位点的序列分析发现,全部100份杂草稻和10份栽培稻的功能SNP位点均为G。以上结果表明,sh4可能是调控雷州杂草稻落粒性的一个主要基因,本研究为雷州杂草稻的落粒机制和起源方式提供分子基础。