在1957年,由Waddington提出表观遗传学（epigenetics）这一概念之前,经典遗传学一直支配着人们对生物遗传理论的认知。随着对生命科学的深入研究,出现了一些无法用经典遗传学解释的生命现象,例如,基因组完全一致的同卵双生即使成长于相同的环境,他们的性格、身体素质等也会存在明显的不同;某些表型只由其中一个亲本的基因决定,另一亲本的基因却保持沉默;马、驴正反交的后代会有较大的差异等。如今,作为遗传学中的前沿分支学科,表观遗传学的发展则为这些现象的理解提供了可能。表观遗传调控是指基于非DNA序列的改变所致基因功能的变化,这些稳定的、可遗传的变化最终导致不同的表型。它与孟德尔的核内遗传规律并不相符,由此认为基因组中可能主要蕴含2种类型的遗传信息：一类是由DNA序列提供的经典遗传信息;另一类则是指导基因表达模式分化的表观遗传信息。如今随着分子生物技术的迅速发展和完善,表观遗传调控在人类医药学、微生物代谢和植物生长发育过程中的研究和应用取得了相当的进展[1]。近几年,表观遗传修饰在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中的开花、响应逆境胁迫、衰老等重要发育过程中的调控机制有了较为系统的认知。本文就植物表观遗传修饰类型及其在植物重要生物学过程中的分子机制进行系统表述。
1 植物表观遗传调控类型及其分子机制
植物表观遗传主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA甲基化、染色质重塑、非编码RNA、基因组印迹和母性效应等典型的调控类型。这些修饰类型彼此关联,通过指导基因的时空表达参与生物学表型的重塑,对维持基因组稳定和植物正常的生长发育至关重要。
1.1 DNA甲基化
DNA甲基化可以通过改变染色质结构、DNA构象、组蛋白修饰以及DNA与蛋白质的相互作用方式调控基因的表达;也可以通过抑制转座子和外源DNA的转录,维持基因组的稳定性,并在植物响应环境胁迫、花期调控、体细胞无性系发育等过程中执行重要功能。真核生物中的DNA甲基化主要以5-mC和N6-mA形式存在,其中5-mC主要围绕增强子和启动子位点富集,是基因转录受抑制的表现,N6-mA则在转录起始位点有较高的丰度,是基因转录活性较高的标志[2]。
目前研究显示植物DNA甲基化主要有2种模式：存在于对称CG和CHG序列中的维持甲基化和非对称CHH（H指A、T和G）序列中的从头甲基化。植物中的从头甲基化被称为RdDM途径,主要由一系列RNA（包括siRNA、scaffold RNA）和蛋白质介导（图1）。在经典RdDM途径中,首先转座子和高度重复序列区域在RNA聚合酶Ⅳ的作用下合成ssRNA（single-stranded RNA）,随后RNA聚合酶RDR2以之为模板合成dsRNA（double-stranded RNA）,接着由DCL3（dicer-like 3）对其切割产生siRNA（short interfering RNA）,经HEN1（hua-enhancer 1）加工修饰后的siRNA招募DRM2（domains rearranged methylase 2）,并与scaffold RNA和AGO蛋白（argonaute protein）结合配对甲基化同源DNA序列[3]。近期研究表明,与RNA聚合酶Ⅳ同源的RNA聚合酶Ⅱ也可诱导非经典RdDM途径。在此途径中,RNA聚合酶Ⅱ不仅可以转录合成siRNA和scaffold RNA,而且可以通过招募RNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ在RdDM靶标区域合成siRNA。CG和CHG维持甲基化分别由甲基转移酶MET1和CMT3介导。CMT3和H3K9me2组蛋白甲基转移酶SUVH4的缺失会降低DNA甲基化水平,但它们在CHG甲基化中的互作机制仍有待了解[4]。同时,DNA甲基化可由DNA糖基化酶/裂解酶ROS1介导的去甲基化途径逆转,存在于基因组中的主动或被动去甲基化可激活沉默状态的基因。被动去甲基化是指基因组中DNA甲基转移酶浓度或活性降低时导致未发生甲基化的胞嘧啶取代已甲基化的胞嘧啶或缺乏甲基供体致使DNA甲基化水平下降。主动去甲基化是ROS1基因家族切除5-mC后由碱基切除修复触发的DNA去甲基化机制。DNA糖基化酶还包DME（demeter）、DML2（demeter- like protein 2）和DML3。
1.2 组蛋白修饰
真核生物中,核小体外伸的组蛋白氨基末端可发生甲基化、乙酰化、丙酰化、丙二酰化、丁酰化、三羟基丁酰化、羟基异丁酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、戊二酰化、棕榈酰化（S-palmitoylation或S-acylation）、磷酸化、泛素化和SUMO化、谷胱甘肽化和亚硝化等修饰类型。这些组蛋白翻译后修饰可通过改变染色质结构或招募下游效应因子调控基因的转录活性。
组蛋白甲基化位点主要定位于H3、H4的赖氨酸和精氨酸残基上,其中组蛋白赖氨酸残基上可发生单甲基化（me1）、二甲基化（me2）和三甲基化（me3）的3种不同状态的修饰。在植物基因组中,H3K9me1和H3K9me2标志着转座子和重复序列富集的异染色质区域,并使异染色质始终处于深度抑制状态。常染色质则主要与H3K4me3和H3K36me3相关,它们均在转录起始位点富集,标记着活性基因的5' 区。由PRC2复合物（polycomb repressive complex 2）介导的H3K27me3也定位于常染色质区域,但与转录抑制相关,并优先作用于活性基因的转录区。果蝇PRC2核心组件包括Esc（extra sex comb）、Su（z）（suppressor of zeste 12）、E（z）（enhance of zeste）和P55;拟南芥基因组编码1个Esc同源蛋白（FIE）、5个P55（MSI1、MSI2、MSI3、MSI5和S14/FVE）、3个Su（z）（VRN2、EMF2、FIS2）、和3个E（z）（CLF、SWN、MEA）,并由这些亚基构成的多种PRC2复合物在植物不同的发育阶段中执行不同的功能[6]。组蛋白精氨酸甲基化则由进化保守的PRMTs（arginine methyltransferases）家族蛋白介导,然而目前我们对精氨酸去甲基化酶知之甚少。鉴于精氨酸和赖氨酸去甲基化酶促模式的相似性,一些研究表明JmjC结构域蛋白可能具有潜在的去精氨酸甲基化作用[7]。
组蛋白乙酰化是由乙酰转移酶HATs介导的转录激活机制,去乙酰化酶HDACs则通过逆转HATs介导的反应发挥转录抑制的作用。基于催化HATs结构域内的序列差异,HATs被分为GNAT（包含HAT1、Gcn5/PCAF）、Rtt109、MYST、p300/CBP 5个亚家族,HDACs则包括组蛋白去乙酰化酶和SIR2调节家族,这些乙酰修饰酶共同调控包括DNA损伤修复、染色质结构和折叠以及核小体组装在内的染色质动力学。组蛋白单泛素化主要发生于H2A和H2B的C端残基上,H2B的单泛素化（H2Bub1）通常与H3K4me3和H3K36me3结合标记着基因组中的活性转录区域[8]。近期发现,H2Bub1可以与EBBP5（retinoblastoma-binding protein 5）结合激活并稳定催化H3K4的COMPASS-like复合物[9]。在拟南芥中,H2Bub1由E2泛素结合酶UBC1和UBC2以及E3泛素连接酶HUB1和HUB2协同催化;转录抑制性标记H2Aub1则由H3K27me3的结合蛋白PRC1催化。此外,H2A的丝氨酸95（H2AS95ph）还携带由MLK4（MUT9-like-kinase 4）催化的磷酸化位点,植物特有的H2AS95ph可富集组蛋白变体H2A.Z和H4乙酰化修饰[10]。总之,这些组蛋白修饰既可在特异的基因组位点各司其职,又可形成错综复杂的信息网络协同调控基因表达。
组蛋白丁酰化来源于丁酸分子的代谢。丁酸分子长期被视为组蛋白去乙酰化酶抑制剂并被用于多种肿瘤的临床治疗。最近我们发现在龙眼体胚发生早期,丁酸盐代谢途径显著富集,推测与其表观遗传修饰有密切关系[11]。
1.3 RNA甲基化
RNA甲基化是一种转录后水平调控基因表达的重要方式,其在丰度较高的rRNA、tRNA以及低含量的mRNA和ncRNA中均有分布。m6A、m5C和m1A是常见的RNA甲基化修饰类型,也包括m7G、m3C、ac4C等。这些修饰发生后可形成识别元件,并嵌入RNA转录序列以介导蛋白质和RNA的互作。
1.3.1 m6A m6A是指腺嘌呤N6位点发生的RNA甲基化类型,是真核生物中丰度最高的RNA修饰。m6A主要在保守基序RRACH（R=G/A; H=A/C/U）中的3'-UTRs、CDS以及终止密码子附近富集,并通过其酶系中的“writers”“erasers”和“readers”3类蛋白介导mRNA的甲基化、去甲基化和识别甲基化。m6A甲基化主要由METTL3、METTL14、VIRMA、WTAP、METTL16等多种酶蛋白构成的甲基转移酶复合体介导,首先WTAP招募METTL3与METTL14形成二聚体,并与之结合校正二聚体的定位以提高催化效率,METTL14则通过激活METT3的蛋白构象促进其与底物的结合,其他酶蛋白则可作为关键催化亚基METTL3的活性调节剂或响应胞间信号招募甲基转移酶复合体到达相应的靶位点。其中METTL16可通过介导mRNA和U6snRNA上的m6A甲基化调控胞内SAM（S-Adenosyl methionine）水平[12]。目前,已知的m6A去甲基化酶主要包括脂肪含量与肥胖相关蛋白FTO和DNA修复蛋白ALKBH2/5。ALKBH2/5去除细胞质中mRNA的m6A修饰,细胞核中的则由FTO和ALKBH2/5共同“擦除”,提示m6A可能具有空间屏障和识别元件的双重作用,这种空间特异性模式可能对响应微环境刺激具有重要意义。目前,笔者已从龙眼（Dimocarpus longan Lour.）中鉴定出一系列m6A同源甲基转移酶MTA70、MTB、FIP37、VIR以及由去甲基化酶ALKBH5编码的ALKBH10B和ALKBH9B,发现它们可能在龙眼不同组织器官的发育、体胚发生以及响应激素应答等过程发挥了重要作用[13]。m6A主要通过“readers”的高效识别介导靶RNA的加工和代谢,“readers”存在调控机制多样,既包括YTH（YT521-B homology）家族蛋白与剪接因子SRSF3、SRSF10、出核因子NXF1以及真核翻译起始因子EIF3等的直接互作介导mRNA的特异性剪切、出核及翻译等,也存在IGF2BP（IGF2 mRNA-binding proteins）家族蛋白维持m6A靶mRNA稳定性的通路,但这些蛋白介导m6A的分子机制还有待深入研究。
1.3.2 m5C 研究表明,mRNA和tRNA m5C修饰位点分布于真核生物和古细菌中,但不存在于真细菌中,mRNA m5C水平在拟南芥不同组织细胞中呈现空间变化,提示m5C修饰的物种保守性和组织特异性[14]。m5C甲基化主要由NSUN（NOL1/NOP2/sun）家族蛋白介导,该家族中的NSUN2（也称为TRM4）成员为mRNA m5C特异的甲基转移酶,主要依赖2个半胱氨酸位点发挥催化活性,它的缺失可导致m5C甲基化水平明显下降。近期,从拟南芥中鉴定出的TRM4B对植株根的发育及响应氧化应激等过程具有重要作用,且TRM4B介导的m5C修饰可能对随后的翻译过程起负面调控作用[14]。此外,DNMT2（DNA methyltrans-ferase 2）是RNA m5C和DNA甲基化的通用甲基转移酶,人体DNMT2介导tRNAAsp的C38和miRNA甲基化,但不介导DNA甲基化[15]。m5C位点发生甲基化修饰后,可与ALYREF特异结合调控mRNA的出核效率。早期研究发现RNA m5C修饰可能通过DNA甲基转移酶TET去除,但近期实验显示TET对RNA中m5C去甲基化起始位点5-mrC的酶解速率远低于对应DNA链中的5-mdC,且目前尚未完全解析TET-RNA复合物的组分,因此TET介导m5C去甲基化机制仍有待明确[16]。
1.3.3 m1A 目前m1A已在不同tRNA的第9、14、22、57和58核苷酸位点鉴定。其中m1A14和m1A22的修饰高度保守,仅存在于哺乳动物中的细胞质（cyt）tRNAPhe和细菌tRNA中,m1A57则仅作为水解脱氨基生成的1-甲基肌苷中间体短暂存在,因此,tRNA的第9和第58位为m1A修饰最佳研究位点。在真核生物中,（cyt）tRNA m1A58特异甲基转移酶是由Trm6和Trm61这2个亚基组成的异四聚体,其中,催化亚基Trm61与辅因子SAM的活性甲基结合,Trm6由于缺少有关辅因子调节的保守基序而无法与之结合。每个异四聚体将2个tRNA分子结合到蛋白质复合物2个远端的‘L’形表面上,在此过程中tRNA中的D环和T环分离,包含待修饰碱基A58的T环通过C56碱基和糖磷酸骨架形成的大量氢键与活性位点稳定结合;真核m1A9甲基化由Trm10介导,但Trm10与HSD10（17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 10）复合才具有甲基转移酶活性,Trm10-HSD10复合物以SAM为甲基供体催化m1A9位点的甲基化[17]。研究表明,m1A9和m1A58均可通过诱导起始tRNA的正确折叠提高其稳定性,其中m1A58去甲基化酶ALKBH1已被鉴定,它的缺失会导致起始tRNA的积累,这与m1A58在起始tRNA结构稳定性的作用一致[18]。此外,m1A富集于mRNA的5'-UTR区,并影响其定位、剪切、翻译和稳定性等,且葡萄糖和氨基酸的含量与mRNA m1A甲基化水平正相关。目前已将ALKB家族中的ALKBH3作为逆转mRNA m1A甲基化并参与其动态调控的候选分子。
1.4 染色质重塑
组蛋白共价修饰和依赖ATP的染色质重塑复合物CRCs（ATP-dependent chromatin remodeling complex）可以通过改变核小体的组成和定位局部或整体重塑染色质结构,从而改变DNA的“可及性”以调节组蛋白和DNA的互作。CRCs依赖其核心亚基SWI2/SNF2 ATPase中共有的DEXDc和HELICc结构域水解ATP供能,在调控基因转录、DNA修复和转录重组等核过程发挥重要作用。基于ATPase结构的差异,CRCs被分为SWI/SNF、ISWI、CHD和INO80/SWR1这4个亚家族,它们具有各自特异的结构域和识别作用（图2）。
1.4.1 SWI/SNF SWI/SNF复合体是植物中最重要的一类保守CRCs,大多数SWI/SNF复合体可通过改变DNA与组蛋白的结合状态体外滑动或分解核小体引起染色质重塑。由1个SWI2/SNF2 ATPase、1个SNF5和2个SWI3亚基构成的SWI/ SNF核心亚复合体即具有基本的染色质重塑活性,这些核心亚基可与一系列转录因子和核蛋白互作调控下游基因的表达,在植物开花、叶片发育、胚胎发生和应激反应等过程发挥作用。拟南芥基因组编码4个SWI2/SNF2（BRM、SYD、CHR12/MINU1、CHR 23/MINU 2）、1个SNF5（BSH）和4个SWI3家族成员（SWI3A, B, C, D）[20]。其中只有BRM（brahma）具有SWI/SNF-ATPase典型的C端Bromo结构域,并被作为组蛋白乙酰化的结合蛋白,Bromo结构域通过与C末端的DNA结合区域构成核小体结合模块介导BRM和其他蛋白的互作,由此推测BRM最有可能是植物SWI/SNF复合体的催化亚基。拟南芥BRM是一个组成庞大、功能多样的蛋白质复合物,由SUMO连接酶MMS21对BRM进行翻译后修饰以维持其稳定性[21]。在拟南芥基因组中,BRM与近1000个基因的启动子和终止子区域互作调节靶基因的转录,表明BRM介导的转录可能受到其他亚基、互作蛋白或特定染色质区域中的不同核小体靶标的影响。此外,核小体的稳定性与组蛋白H2A和其变体H2A.Z的替换相关,研究表明,SWI/SNF和H2A.Z定位于拟南芥基因组中数千个位点,它们在这些位点中既相互作用又彼此拮抗,共同调控相关核小体动力学[22]。
1.4.2 ISWI 在真核生物中,ISWI蛋白通过与DDT结构域蛋白（DNA-binding homeobox and different transcription factor）形成保守CRCs改变核小体的位置;在此过程中,ISWI-ATPase C端的SANT、SLIDE结构域通过与核小体连接DNA互作将ISWI蛋白锚定在核小体上,并促进核小体延DNA链滑动。拟南芥基因组编码的2种ISWI蛋白CHR11和CHR17负责调控核小体在基因区的分布“间距”,并通过与多种DDT结构域蛋白互作影响植物营养器官和花器官的发育[23]。
1.4.4 INO80/SWR1 与其他亚家族相比,INO80/SWR1家族重塑因子的ATPase结构存在一个相当长的“插入区”,用于招募Rvb1/2解旋酶。该家族包含重塑因子INO80和SWR1,INO80复合体催化核小体H2A-H2B取代H2A.Z-H2B,SWR1则反向催化二聚体的替换。在真核生物中两者高度保守,并共享RVB1和RVB2等多个不可或缺的亚基。但也具有各自特异的组成单位,其中ARP5和ARP6分别为INO80和SWR1的高度特异性亚基。拟南芥INO80同源蛋白AtINO80与ARP5互作,对复制胁迫条件下染色体稳定性的维持具有重要作用[26]。然而,AtINO80向局部染色质的募集会受到ARP6介导的H2A.Z定位的影响。ARP6作为SWR1的特异亚基,最近被证实与ISWI的作用蛋白MBD9（methyl-CpG- binding domain 9）存在组合互作[27];另外,ARP6和ARP5可联合SWR1的其它核心亚基包括PIE1、SWC6参与调节DNA DSB（double-strand breakage）修复途径同源重组的频率。总之,INO80/SWR1复合体在DSB修复、染色体分离等多种核过程中存在亚基互作和组蛋白串扰,然而对其部分亚基包括RVB1、RVB2A/2B和精确的重塑机制如复合体被招募到其靶位点的途径仍是未知。
1.5 非编码RNA
非编码RNA（non-coding RNAs, ncRNAs）是一类由生物体基因组转录产生的含有遗传物质但不编码蛋白质的分子。全基因组和转录组测序结果表明,超过50%的拟南芥基因组可转录成RNA,其中绝大多数是缺乏蛋白编码能力但在真核生物的生长发育和应激反应中发挥重要作用的ncRNAs。根据ncRNAs的功能差异,将其分为组成型ncRNAs（constitutive ncRNAs）和调控型ncRNAs（regulatory ncRNAs）两大类,前者包括tRNA、rRNA、snoRNA（small nucleolar RNA）、snRNA（small nuclear RNA）,后者主要包括miRNA（microRNA）、lncRNA（long ncRNA）和siRNA等。其中,调控型ncRNAs中研究最为透彻的miRNA是一类长为20~24 nt且高度保守的小分子RNA,通过与靶位点的碱基互补配对实现转录本的切割、降解和翻译抑制,从而参与调节植物的生长发育。与miRNA不同,lncRNA是一类序列长度超过200 nt、作用机制复杂多样的低保守性转录物,主要与大分子DNA、RNA和蛋白质等组合互作,在转录、转录后和表观遗传水平调控RNA代谢、蛋白质修饰、染色质重塑等,同时lncRNA的转录、剪切也受到DNA甲基化、RNA和组蛋白修饰的调节。研究表明,lncRNA主要通过参与信号通路、募集RNA结合蛋白、招募核糖核蛋白或染色质修饰酶至特定位点以及作为核糖核蛋白复合物的组合支架靶向蛋白质编码基因[28]。
1.6 基因印记
基因印记（genic imprinting）是指在配子或合子发生期间,来自不同亲本的等位基因由于受到DNA甲基化和FISPcG介导的组蛋白差异修饰而表现偏好亲源的选择性表达。其中母源特异表达而父源被印记或沉默的基因称为母本表达的印记基因（maternally expressed imprinted gene, MEG）,反之称为父本表达的印记基因（paternally expressed imprinted gene, PEG）。近几年相继在拟南芥、高粱（Sorghum bicolor）和水稻中发现多个印记基因,其中只有4个被鉴定为PEG（PHE1、PEG1、HDG3和At5G62110）,而有20个表现为MEG印记。这些印记基因绝大多数在胚乳中表达,它们可通过调控早期胚乳的细胞化决定种子发育大小,并在种子花青素的合成以及营养物质的运输与分配中发挥重要作用。
1.6.1 MEG印记机制 植物基因组中由差异DNA甲基化形成MEG等位基因表达和沉默的机制主要与DNA糖基化酶DME的特异表达相关。DME具有5-mC切除活性,并在雌配子体的中央细胞中特异表达,同时DNA甲基转移酶MET1的表达受到成视网膜细胞瘤途径（retinoblastoma pathway）的抑制,此途径涉及RBR1（retinoblastoma related1）及其伴侣分子MS1（multicopy supressor of ira1）的作用;但MET1的单独抑制并不足以移除MEG母源等位基因的甲基化印记,因此,MEG在卵细胞中缺乏DME和MET1被抑制的情况下仍维持甲基化状态。雄配子体中的MET1虽正常表达,但不存在DME的活性转录,因此最终只有MEG母源等位基因在胚乳中表达,而在胚胎中保持沉默[29]。
1.6.2 PEG 印记机制 目前有关PEG的印记机制主要在印记基因PHE1的研究中较为完善,PHE1等位基因的表达与多梳抑制复合体FISPcG2相关。在雌配子体的中央细胞中,DME的特异表达导致PHE1 3'端差异甲基化区（differentially methylated region, DMR）的去甲基化,随后FISPcG2复合体与PHE1启动子区的多梳响应元件（polycomb response element, PRE）和去甲基化的DMR形成稳定的染色质内环,同时FISPcG2复合体通过催化H3K27me3的形成抑制PHE1的表达;而在雄配子体中由于DMR的甲基化修饰和FISPcG复合体的缺失,PHE1的启动子区域不含或含有少量的甲基化位点,因此,PHE1的父源等位基因在胚乳中活跃表达[30]。
1.7 母性效应
母性效应是指在不改变遗传因素的条件下,由母本核基因影响或决定其子代某一性状的表现型,以缓冲子代在异质环境中的生存压力增强其适应性。早期胚胎的发育即涉及典型的母性效应。自受精开始,特异储存在卵母细胞中的一些基因启动表达,其转录产物mRNA或编码蛋白质在卵母细胞向胚胎的过渡中发挥着关键的作用,而这些基因（母性效应基因）一旦有所缺失,即使相应的父源基因正常表达也会导致胚胎发育缺陷或停滞。目前,植物中有关母性效应基因的研究主要集中于拟南芥,拟南芥母性效应胚胎滞育基因MEE/MIS1是FISPcG2的组成亚基,负责调控印记基因的表达与沉默[31];MEE/MIS1在拟南芥响应干旱胁迫、适时开花和胚珠发育等过程中发挥着重要的作用。我们从龙眼中鉴定出的拟南芥MEE/MIS1同源基因MEE70-1a/b主要定位于过氧化物酶体和细胞核,生物信息学分析显示它们可能协同调控种子萌发和胚胎发育等过程,与拟南芥相比可能具有更复杂的代谢途径[32];但迄今为止,母性效应在植物中的研究较为落后,其在早期胚胎发育中的详细调控机制仍需进一步研究。
2 植物表观遗传的生物学功能
2.1 细胞增殖
表观遗传修饰广泛参与了细胞对基因表达的控制,在细胞生长、分化、增殖和疾病状态中起关键性的作用。Pathania等[33]研究发现DNA甲基转移酶DNMT1对于乳腺干细胞和癌症干细胞的维持是必不可少的,在乳腺发育和肿瘤发展中起到了重要的作用;EZH2（enhancer of zeste homolog 2）主要对组蛋白H3K27进行甲基化,由此沉默下游基因,在细胞增殖、分化和肿瘤形成方面起到了重要的作用。Yin等[34]通过研究表明,EZH2通过组蛋白甲基转移酶活性调控了NK（natural killer）细胞的分化和功能,去除EZH2或抑制其活性可以促使造血干细胞及祖细胞生成更多更强的NK细胞。此外,表观遗传调控异常会干扰干细胞功能和组织内稳态,其严重程度取决于出现问题的组织类型和表观遗传学调控子。
愈伤组织的形成是高等植物组织培养中器官从头再生过程的一个关键步骤。近年的研究发现Polycomb和ISWI表观遗传通路对于叶片形成愈伤组织至关重要。Polycomb通过组蛋白甲基化途径控制基因组表观信息在细胞命运转变中的重排,主要负责沉默叶特征基因的表达。ISWI是ATP依赖型染色质重塑因子,在拟南芥中由CHR11与CHR17两个基因编码,chr11-1、chr17-1双突变体可导致其叶片外植体无法再生愈伤组织[35]。
植物器官的发育取决于精细的生长调控。组蛋白去乙酰化酶HDACs通过形成具有不同调节亚基的多种共抑制因子复合物来实现其在特异的组织或细胞中的功能,调节特异靶标基因的表达。其中,HDC1（histone deacetylase complex 1）作为核心与HDAC复合物的多个组成蛋白相互作用,调节植物的器官大小。最近,Zhang等[36]报道了黄瓜（Cucumis sativus）果实细胞增殖的表观遗传调控机制,该研究鉴定了一个细胞增殖受到抑制的短瓜突变体sf2。SF2编码了一个拟南芥HDC1的同源蛋白,主要在分生组织中表达,这与其通过HDAC复合体调节细胞增殖的作用相一致。在sf2突变体中,SF2第515位的甘氨酸（G）突变为谷氨酸（E）,导致SF2在全基因组水平的结合能力减弱,组蛋白乙酰化水平升高。全基因组水平比对分析表明,SF2直接靶向并促进多种植物激素途径和细胞周期调控关键基因的组蛋白去乙酰化,并在细胞增殖过程中抑制或激活它们的表达。进一步研究表明,SF2通过直接靶向细胞分裂素和多胺的生物合成与代谢来控制果实细胞增殖。
2.2 细胞分化
细胞分化是指多能性细胞特化为不同类型细胞的过程,这一过程依赖于表观遗传修饰对发育调控因子时空表达的有序调节。研究表明,大麦（Hordeum vulgare）小孢子重塑胚胎发育的过程中伴随着细胞命运和发育程序变化的DNA甲基化重编程,DNA甲基化在胚细胞第一次发生分裂的过程中维持低水平状态,但随着后期胚胎的分化逐渐升高[37];玉米（Zea mays）叶片组织细胞从增殖到分化的过程中伴随着DNA甲基化水平的显著变化,其中参与细胞周期、染色质重塑等过程的基因发生了差异甲基化,但基因区内的差异甲基化与转录水平无相关性,只有位于基因上游的差异甲基化与转录负相关。近期研究发现,组蛋白修饰复合物PcG-PRC2突变体中H3K27me3的缺失导致多个阶段的发育异常,包括愈伤组织再生、胚胎到幼苗的过渡[38]。此外,PRC2组件CLF突变体中根分生组织调节因子WOX5（wuschel-related homeobox 5）、PLT（plethoral）和AGLs（agamous-like）被显著上调,最终导致根干细胞活性增强和分生区扩大,而染色质重塑因子PKL突变体则表现出了相反的表型,提示PcG可能通过拮抗PKL维持根分生组织活性[39]。最近研究表明,PKL参与植物基因组H3K27me3的动态调节也支持了这一推断[25]。另外,组蛋白乙酰转移酶GCN5和重塑子BRM可通过调控PLT的表达参与根尖干细胞微环境的调节,然而GCN5是否通过调节PLT的乙酰化水平影响其表达还有待证明。在水稻中,转录因子WOX11通过募集GCN5及其互作蛋白ADA2激活下游基因的转录,从而促进冠根的伸长;而组蛋白去乙酰化酶HDT1/2可通过靶向赤霉素氧化酶GAox2的启动子区抑制其在分生区的表达,对调节根尖静止中心的细胞分裂发挥了重要作用[40]。在茎尖分生组织中,AG（agmous）在WUS（wuschel）位点通过招募CLF、EMF2等PcG因子抑制其表达,最终在干细胞身份无法维持的情况下促进花器官的形成[41]。在胚胎发生的过程中,KNOX（knotted1-like homeobox）负责维持周边区内部细胞的增殖和未分化状态,而PcG组件LHP1、CLF、VRN2、FIE、RING1A/B和EMF4参与了KNOX的转录调节[42]。总之,PcG介导的转录抑制在平衡细胞增殖和分化中发挥了关键的作用。
2.3 生物胁迫
植物通过病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）和效应器触发的免疫（ETI）保护自己免受病原体的攻击。PTI和ETI途径的激活依赖于多种调节机制严格调控的转录重编程。研究发现PolⅤ依赖型DNA甲基化的缺失增强了拟南芥对丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的免疫[43]。在小麦（Triticum aestivum）中,接种白粉菌（Blumeria graminis f. sp., Bgt）通过降低AGO4a相关联的siRNA水平下调CHH甲基化,从而激活AeGlu/PR2-like等防御基因以增强对Bgt的抗性,提示DNA甲基化可能作为细菌和活体营养性真菌抗性的负调控因子[44],这与早期DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-azadeoxycytidine）处理增强水稻白叶枯病细菌抗性的实验结果一致。然而,RdDM通过促进茉莉酸信号正调节植物对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和黄瓜枯萎菌（Plectosphaerella cucumerina）等死体营养性真菌的抗性,提示植物的免疫应答途径中存在不同的DNA甲基化调节机制[45]。与此类似,染色质重塑复合体SWR1和H2A.Z也可诱导拟南芥对活体和死体营养病原物不同的防御机制。在水稻中,SNF2类重塑因子BRHIS1通过与单泛素化组蛋白变体包括H2B.7和H2A.Xa/Xb/3互作促进不依赖水杨酸信号防御基因的表达,从而诱导对稻瘟病菌的先天免疫[46]。植物免疫也需要SDG组蛋白甲基转移酶依赖性转录组的2个基因CCR2和CER3。它们分别编码类胡萝卜素和角质层腊质生物合成酶。研究表明SDG8/25突变体中H2Bub1靶向的抗病基因SNC1以及CCR2、CER3位点的H2B泛素化水平均显著降低,提示SDG8/25可能通过影响H3K4、H3K36甲基化水平直接或通过H2B泛素化间接调节免疫基因的表达[47]。
2.4 非生物胁迫
2.4.1 低温胁迫 CBF（C repeat binding factor）- COR（cold responsive）是植物低温响应机制的核心组分。研究发现染色质重塑因子PKL介导了CBF-COR低温应答途径,PKL参与RdDM途径的调节,并通过与组蛋白甲基转移酶CLF和SWR1类染色质重塑因子PIE1协作调控COR基因中的H3K27me3水平,因此,PKL可能通过H3K27me3的转录抑制效应调节COR基因的染色质状态以响应低温胁迫[48]。此外,低温胁迫转录因子的表达还受组蛋白乙酰化酶HAT和去乙酰化酶HDAC的动态调节。正常条件下,拟南芥去乙酰化酶HD2C被活性转录的E3泛素连接酶HOS15募集至COR的启动子区,并通过去乙酰化作用抑制其表达。低温处理下,HOS15介导的HD2C泛素化降解可提高COR的乙酰化水平,同时转录因子CBF被招募至下游COR的启动子区以提高其转录活性[49]。在血橙（Citrus sinensis）中,低温胁迫可以特异诱导果实中反转座子的转录激活,从而促进下游Ruby基因的表达以影响随后的花色苷合成[50];但在不同品种中花色苷合成所需的Ruby表达水平有较大差异,提示合理利用低温胁迫可以形成理想的农艺性状。
2.4.2 高温胁迫 表观遗传修饰在植物的高温应激反应中主要具有3个方面的信号转导途径。其一,高温应答途径中的核心转录因子HSFA1（heat shock transcription factor A1）负责激活下游HSFA2的表达,随后HSFA2通过招募H3K9ac和H3K4me3促进下游APX2、HSP18、HSP22等热休克基因的转录[51];其二,高温胁迫通过克服RdDM途径对其靶标SDC（suppressor of drm1 drm2 cmt3）的沉默效应诱导下游热休克基因的表达[52];其三,高温胁迫通过诱导ONSEN（Ty1/ Copia-like）反转座子的激活介导“跨代”胁迫记忆的形成,此过程中ONSEN的活性受RdDM途径中siRNA的严格调控。早期研究发现HSPs（heat shock proteins）和HSFs的表达水平与水稻、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物的耐热能力呈正相关,如番茄HSP21和大豆HSFA1的过表达可分别增强它们在高温胁迫中的耐受性,但在无胁迫条件下也会对它们产生生长迟缓等负面作用[53]。
2.4.3 盐胁迫 在植物中,HKT1（high-affinity k+ channel 1）与SOS（salt overly sensitive）途径协作赋予植物在盐胁迫下的耐受性。正常条件下,RdDM依赖型的DNA甲基化使拟南芥HKT1和盐诱导转录因子MYB74维持低水平的转录,然而在盐胁迫条件下随着MYB74的上调表达,几乎无法检测到其甲基化和siRNA活性[54]。小麦HKT1也具有类似的DNA甲基化调节途径,盐胁迫特异诱导盐敏感和耐盐基因型品种芽和根中的m5C甲基化,从而抑制HKT2;1和HKT2;3的表达,然而根中HKT14的下调与m5C的甲基化作用无关[55]。此外,组蛋白修饰如甲基化、乙酰化和磷酸化也参与植物的盐胁迫应答途径。在正常处理下,2种组蛋白去乙酰化酶HD2C和HDA6协作抑制脱落酸响应因子ABA1和ABI2的表达。其中,ABI2介导SOS2途径的失活及其靶标的去磷酸化,高盐条件会抑制HD2C的活性,并诱导与染色质密度相关的H3 Ser-10磷酸化,H3K9K14ac和H3K4me3等活性转录标记被募集到盐胁迫应答因子中,而H3K9me2和H3K27me3等抑制转录标记明显下调。研究表明,高盐处理下拟南芥HKT1的转录激活与其基因区H3K27me3的去除相关[56]。此外,H3、H4的乙酰化和H3 Ser-10磷酸化水平在拟南芥和烟草（Nicotiana tabacum）的不同胁迫反应中均明显上调,但具有不同的调节机制。
2.4.4 干旱胁迫 干旱胁迫诱导ABA的生物合成,ABA则对植物的抗旱性起反馈调节作用。干旱胁迫可降低胁迫应答因子RD29A和RD29B启动子区的核小体密度,该区域所含的ABRE（ABA-responsive element）可通过招募AREB（ABA-responsive element binding 1）和DREB（dehydration responsive element binding protein）促进RD29A和RD29B的表达,且干旱持续时间与它们的表达量呈正相关。研究表明,SWI/SNF染色质重塑因子的核心组分CHR12在干旱胁迫诱导的拟南芥瞬时生长停滞中发挥作用,另一组分SNF5在豌豆（Pisum sativum）的应激反应中诱导表达,提示SWI/SNF重塑复合物对不同植物干旱响应途径中染色体结构的调节具有重要作用[57]。此外,干旱响应基因的表达还受组蛋白修饰的动态调控。ABA关键合成酶NCE3的活性与其基因区内H3K4me3的水平相关,RD29A、RD29B、RD22和RAP2.4等干旱应答因子的启动子区通过富集H3K4me3和H3K9ac实现活性转录,这些组蛋白活性标记的丰度还随着干旱程度的升高而升高。而在胁迫恢复的过程中,H3K9ac拥有比H3K4更快的降解速度[58]。最近研究发现,干旱胁迫应答因子中H3K27me3水平的降低也是赋予植物抗旱性的因素之一,其结合蛋白PRC1复合物通过转录抑制干旱响应的NAC转录因子ANAC019和ANAC055对ABA依赖的抗旱性起负调控作用。在毛果杨（Populus trichocarpa）中,多数NAC家族成员的启动子区含有ABRE元件,AREB可与之结合,并招募ADA2b-GCN5组蛋白乙酰转移酶将H3K9ac富集于NAC中以促进其表达,进而增强植物的抗旱性[59]。对毛果杨的进一步研究发现,干旱胁迫诱导的DNA甲基化指导相关基因的表达,但其调控机制仍处于未知状态。已证实含有转座元件MITE的玉米NAC111可通过H3K9me2和RdDM途径抑制干旱胁迫应答基因的表达[60]。
2.5 开花
不同类型的花器官由各轮中同源异型A、B、C、D、E基因的特异组合所决定,大多数植物的花同源异型基因编码MADS结构域蛋白,其中A类基因编码AP1（apetala 1）和AP2,B类编码AP3和PI（pistillata）,C类和E类则分别编码AG和SEP（sepallata）转录因子。Smaczniak等[61]根据拟南芥花发育过程中的标志性事件将其划分为12个阶段,在第1~2阶段即花原基形成期间,花同源异型B和C类基因的表达被EMF2-PRC2复合物介导的H3K27me3沉默,SWI/SNF重塑因子SYD、BRM被成花关键基因LFY（leafy）、SEP3招募至AG和AP3位点进行转录激活。与此同时,H3K4me3甲基转移酶trxG蛋白ULT1通过与同源ATX1/SDG27互作激活AG和其他MADS家族基因的表达。从第3阶段花萼原基出现开始,AG通过招募PcG抑制WUS,并通过驱除KNU（knuckles）基因座中的PcG诱导其转录,直至第6阶段完全沉默WUS并终止花干细胞的分化。在此过程中,乙酰转移酶AtGCN5可能参与调节AG和WUS的时空表达,同时H3K27me3去甲基化酶REF6通过与AG和SEP3互作促进下游靶标包括诱导雄蕊和心皮正常发育因子的转录[62];在第6阶段,MADS通过招募染色质重塑因子CHR4/11/17与SEPs、AP1、AG、PI和AP3等同源异性蛋白形成复合物调节长雄蕊房室的发育[63]。在第8~12阶段,H3K4甲基转移酶SDG2可能在雌雄配子体发育过程中介导基因的活性转录,而FIS2-PRC2复合物在配子发生和种子发育过程中的基因沉默中起作用。此外,H3K36甲基转移酶SDG4在花粉管的形成中发挥重要作用。在花的转变过程中,关键开花阻遏基因FLC（flowering locus C）需要被多梳响应元件PRE和染色质重塑因子INO80与H2A.Z的互作所沉默。此外,SWR1有利于FLC的转录激活,最新研究发现其组成亚基YAF9A在控制开花方面存在一条依赖H4和H2A.Z乙酰化的新型调控通路[64]。
2.6 果实成熟
近年研究发现m5C、m6A以及组蛋白甲基化在番茄果实成熟过程中建立了重要的分子联系,其中非活性转录的DNA甲基化通过靶向m6A去甲基化酶ALKBH2调控m6A水平,ALKBH2则作用于ROS1高度同源的DML2对DNA甲基化进行负反馈调节,同时DML2通过催化成熟诱导基因的去甲基化以激活它们的转录,包括参与细胞壁水解（PG2a、PL）、类胡萝卜素（PSY1、Z-ISO、ZDS）以及乙烯生物合成和信号转导的基因（ACS、ACO和ETR）,从而促进果实的成熟和软化,ALKBH2是否同时靶向这些基因还有待进一步研究[65,66];而组蛋白去甲基化酶JMJ6既可以通过降低DML2的H3K27me3水平促进其表达,也可以直接靶向相关基因参与果实成熟的调节[67];此外,HDA1型组蛋白去乙酰化酶HDA1和HDA2的下调可促进乙烯的生物合成和类胡萝卜素的积累,进而加速果实成熟,而HD2型去乙酰化酶HDT3的沉默却发挥相反的作用,组蛋白乙酰化与甲基化是否存在联系仍是未知[68,69,70]。草莓（Fragaria ananassa Duch.）果实的成熟也需要全基因组范围的DNA低甲基化,但在此期间DML2并不被上调,DNA甲基转移酶和RdDM活性的降低导致DNA去甲基化占据主导地位[71];香蕉（Musa nana Lour.）HDA1则通过与转录因子ERF11（ethylene response factor11）互作抑制成熟相关基因的表达[72],提示诱导果实成熟的调控机制可能因其种类而异。
2.7 胚胎发育
众多研究表明,不同表观遗传调控类型介导了植物胚胎的发育,其中最主要的是DNA甲基化和组蛋白修饰。Bouyer等[73]研究发现成熟胚胎中CHH甲基化增加导致总DNA甲基化水平升高,CHH甲基化在早期和成熟胚胎中的差异在富含转座子和基因缺乏的着丝粒周围区域中最为明显,提示胚胎发育过程中染色体存在不同的甲基化动力学。对拟南芥DNA甲基化相关基因MET1和CMT3功能缺失突变体研究发现,其胚胎发育在细胞分裂平面和数量发生异常变化,且胚胎生存能力降低。两种组蛋白去乙酰化酶HDAC6/ HDAC19也在胚胎发育中具有重要的调控作用,在拟南芥萌芽过程中,HDAC6/HDAC19通过抑制胚胎特异性基因功能直接或间接冗余的调控胚胎特性[74]。在种子发育期间,CHD类染色质重塑因子CHR5和PKL通过拮抗作用于染色质不同方面的修饰调节胚胎发育因子的转录,CHR5可通过克服核小体屏障与ABI3（abscisic acidinsensitive 3）和FUS3（fusca 3）的启动子区结合,并降低转录起始位点附近的核小体密度;PKL则通过促进H3K27me3抑制相关基因的表达[75]。此外,种子发育的核心调控因子LEC1（leafy cotyledon 1）通过与不同转录因子互作参与调控胚胎形态发生和种子成熟等多个生物学过程。近期揭示了LEC1在早期胚胎中通过激活FLC重置春化状态的分子机制。在胚胎发育早期,LEC1通过在FLC位点募集组蛋白甲基转移酶EFS和染色质重塑因子SWR1C促进H3K36me3水平的升高和转录抑制标记H3K27me3的消除,由此形成的FLC活性染色质状态持续到整个胚胎发育时期及幼苗期,随后冬季低温则通过招募PRC2复合体富集H3K27me3以沉默FLC活性状态,并使这种沉默状态维持到春季回暖期形成“低温记忆”,这种记忆直至胚胎发育早期以LEC1激活FLC的形式被擦除[76]。
植物体胚发生过程中基因的时空表达同样受到表观遗传修饰尤其是DNA甲基化的动态调节。DNA甲基化模式的改变或修饰可参与植物体胚发生的启动和发育过程中多种候选标记基因的调控。例如在辐射松（Pinus radiata D. Don）体细胞胚胎发生中,SERK1（somatic embryogenesis receptor-like kinase）、BBM（baby boom）和WOX2（WUS homeobox 2）基因的表达水平降低与DNA甲基化总体水平的增加相关[77]。此外,生长素可能以SAM和SAH（S-腺苷半胱氨酸）为媒介调控DNA甲基化。在培养基中去除2,4-D时可抑制乙烯的生物合成,引起SAM与SAH的浓度比值升高并最终导致DNA甲基化水平增加[78]。近期研究发现DNA和组蛋白甲基化在体胚诱导过程中存在不同的组合互作,其中RdDM和H3K9me2可能协同促进陆地棉（Gossypium hirsutum）NEC（non-embryonic callus）到EC（embryonic callus）阶段的CHH甲基化动力学,而在EC至SE（somatic embryo）阶段中伴随着DNA甲基化和H3K9me2水平的降低;在中粒咖啡（Coffea canephora）中,DNA甲基化的减少和H3K9me2、H3K27me3水平的降低相关[79,80]。
总之,以DNA甲基化和组蛋白修饰为代表的表观遗传调控在植物胚胎发育过程中发挥着至关重要的作用。
3 展望
表观遗传修饰广泛地参与了植物的生长发育,重要发育因子中表观遗传标记的动态变化导致染色质“可及”状态的改变,进而在转录或翻译水平调节发育因子的表达。然而,表观遗传在植物响应非生物及生物胁迫、胚胎发育、果实早期发育中的作用机制仍不清楚。例如,对非生物胁迫如何通过表观遗传调节染色质状态和随后的转录重编程仍缺乏完整和清晰的认知。总之,关于植物生长发育过程中的表观遗传密码仍需要更深入的研究。在植物表观遗传的高通量测序和染色质分析技术快速发展的背景下,越来越多的植物表观基因组将会被破译,这将大大促进我们对模式植物及农作物生长发育过程中表观遗传调控机制的研究、理解和应用。植物表观遗传在农业上应用前景广阔,研究表明,玉米、杉木（Cunninghamia lanceolata）和高粱的亲本和杂种之间的特异基因组位点存在差异甲基化,水稻自交系之间也存在类似甲基化模式的差异,并且与F1代杂种某些DMRs的转录水平相关。这些发现支持了表观遗传调控与杂种优势之间的潜在联系。最近,在龙眼上进行了一系列体胚发生的关键基因包括RNA甲基化m6A修饰酶基因、组蛋白甲基化SDG基因家族的鉴定,以及DNA甲基化基因鉴定和甲基化水平的测定为利用表观遗传修饰的调控培育无核或焦核龙眼新品种的培育奠定了基础。此外,龙眼母性效应基因MEE70的鉴定也为稳定无籽育种工作的开展提供了良好的理论基础。总之,众多关于表观遗传修饰在植物重要发育过程中的研究暗示了其在杂种优势利用、多倍体育种、抗性育种、开花与花形态调控、胚胎发育调控、果实成熟调控等领域具有巨大的应用潜力,这将开辟新的育种思路,特别是结合基因编辑调控表观遗传的分子育种,将会显示出巨大的应用潜力。