兜兰（Paphiopedilum）由于其独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值,是国际花卉市场上十分流行的高档花卉,在世界上有着大量的爱好者,在我国也将可能成为继蝴蝶兰、大花蕙兰、石斛兰后又一类极具市场前景的观赏兰花,市场前景十分巨大。然而,兜兰由于其种苗繁殖难度大,栽培周期较长等原因,远不能满足市场的需求,从而导致其野生资源被过度采挖,同时,由于其生存环境的恶化,兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一,所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录I而被禁止交易。要进行兜兰种质资源的有效保护和可持续利用,突破其繁殖技术瓶颈是关键[1]。
兜兰的传统繁殖方法常采用分株繁殖,即分割丛生的假鳞茎后独立栽培,但繁殖系数低,繁殖速度慢,难以满足物种保护和商品生产的需求。兜兰的种子和其他兰花种子一样细小如尘,无胚乳,在自然生境中需要与真菌共生才可萌发。在无菌播种技术发明前已有人采用种植过兜兰的盆土或从兜兰原生地采集土壤,利用土壤中的共生真菌进行种子共生萌发[2];在无菌播种技术发明后,有人在营养培养基上加入从兜兰中分离到的共生真菌促进种子萌发,但操作较为繁琐。兜兰的组织培养能保持母株优良特性,但由于灭菌时去污染难、增殖速率慢等原因,世界上还没有利用组织培养技术进行种苗规模化生产的报道[1,2]。自1922年法国Kundson建立了非共生萌发（asymbiotic germination）技术以后,使得兰花种子在人工培养基上高效萌发,从而推进了兰花产业化的进程[3],目前,无菌播种是兜兰最有效的繁殖手段[4]。本文对兜兰属植物的无菌播种、共生萌发和组织培养进行全面综述,并提出了目前存在的问题和解决方法,以期为兜兰属植物繁殖技术的深入研究和优质种苗的规模化生产提供参考。
1 离体繁殖的兜兰种类和品种
2 无菌播种研究进展
兜兰是兰科植物中无菌播种最困难的种类之一。影响兜兰属植物种子非共生萌发的因素主要包括种子成熟度、预处理方法、培养基成分（包括基本培养基、pH值、碳源、植物生长调节剂、有机添加物、活性炭）、培养方式（固体培养、液体培养和液–固体分层培养等）和培养条件（包括培养温度、光照）等[1]。
2.1 种子成熟度对其萌发的影响
种子成熟度是影响兜兰种子非共生萌发率的一个关键因素,已报道的兜兰种子通常在一个合适的胚龄期萌发率最高,完全成熟的兜兰种子常常较难萌发[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。兜兰从授粉到种子成熟,不同兜兰所需的时间长短不同,兜兰种子最合适的萌发时期因种类而异,如菲律宾兜兰（P. philippinense）和古德兜兰（P. goodefroyae）最佳萌发期为授粉后90 d,报春兜兰（P. primulinum）为授粉后110 d,巨瓣兜兰（P. bellatulum）为授粉后130 d,白花兜兰（P. niveum）、海伦兜兰（P. helenae）、亨利兜兰（P. henryanum）、白旗兜兰（P. spicerianum）和德氏兜兰（P. delenatii）为授粉后150 d[8, 12]。Zeng等[15]报道彩云兜兰（P. wardii）在授粉后180 d时萌发率最高,Zhang等[16]报道杏黄兜兰（P. armeniacum）授粉后95 d时萌发率最高,但授粉后110 d时成苗率最高。同一种类在不同的实验中也表现出差异,如陈之林等[9]报道,杏黄兜兰和硬叶兜兰（P. micranthum）在授粉后120 d的种子可萌发,萌发率约为32.4%和25.2%,而授粉后180 d的种子不能萌发;丁长春等[10]报道,杏黄兜兰授粉后60 d时就能萌发,萌发率约为3.5%,随后萌发率逐步升高,授粉后120 d时达到最高40.6%,随后逐步下降,180 d时约为22.9%。Lee[18]报道授粉后150 d的种子在1/4 MS培养基中的萌发率为68.0%,高于授粉后3个月的20%。Nhut等[19]报道,德氏兜兰授粉后9个月的种子在Knudson C培养基中萌发率为90.1%,高于授粉后3个月的0%或授粉后6个月的8.8%。陈莹等[21]报道,白旗兜兰在授粉后270 d的种子萌发率最高,为17.72%。太过幼嫩的种子萌发率低的原因在于其种胚未发育成熟,需要更多的时间进行器官形成或进行营养物质的合成以利于从培养基中吸收营养物质而萌发[16, 19]。成熟的种子萌发率低的原因可能是成熟的种子形成了不可渗透的种皮,阻碍了水分和营养物质的吸收[17, 22],或者在种子中出现了抑制种子萌发的物质如脱落酸（ABA）等,或者缺少促进种子萌发的激素如赤霉素等[23]。Lee[18]报道,德氏兜兰种子在授粉后150 d时萌发率为68%,此时,种子角质层尚未形成,胚柄细胞多液泡,有利于萌发时功能物质的吸收[11];而210 d时大部分种子已形成角质层,萌发率也仅为31%。Zhang等[16]在杏黄兜兰的研究中得到了相似的结论,Fang等[22]利用转录组数据和基因表达分析结果得出,种子中非甲基化木质素的积累和萌发率呈正相关。值得注意的是,尽管未成熟的种子具有较高的萌发率,但无论如何,太幼嫩时往往成苗率较低[15],而成熟的种子更有利于种子保存。
2.2 种子预处理对其萌发的影响
对于难以萌发的地生兰种子,播种前进行适当的预处理可以提高种子的萌发率。预处理方法主要有物理方法（机械损伤、超声波、低温处理等）和化学方法（氯化钠、次氯酸钠溶液、氢氧化钠、氢氧化钾、蔗糖溶液处理等）,这些物理或化学方法处理可能通过破坏种皮从而增加了种皮的通透性或减少了种皮中抑制物质的含量[12, 23-24]。在化学处理方法方面,前人已利用氢氧化钠、氢氧化钾、次氯酸钠和次氯酸钙处理等方法来提高兜兰种子的萌发率,如廖玉珠等[13]报道,利用0.05 mol/L NaOH处理30 min,P. St. Swithen × P. malipoens 种子的萌发率从6.9%上升到17.95%;用0.1 mol/L NaOH处理10 min,P. rothschildianum× P. malipoens的萌发率从25.92%上升到40.4%。胡琦敏等[25]报道海伦兜兰种子较好的预处理方法是用0.1 mol/L KOH处理10 min,成熟种子萌发率可达44.0%。Lee[12]采用1%次氯酸钠溶液处理巨瓣兜兰、白花兜兰、海伦兜兰、亨利兜兰、白旗兜兰和德氏兜兰6种兜兰种子60~75 min时,均提高了种子的萌发率。Chen等[26]报道采用1%次氯酸钠溶液对白旗兜兰处理40 min的效果最好。过长时间、过高浓度的处理可能破坏种子的胚而降低萌发率[15, 24]。Fu等[24]采用0.5%的次氯酸钠溶液处理60 min时,Paphiopedilum SCBG Red Jewel成熟种子萌发率最高,为58.1%,而在采用40 kHz的超声波处理时,处理8 min的效果最好,萌发率可达到54.0%,而对照只有37.0%,具有显著差异。Zeng等[15]报道0.5%的次氯酸钠溶液处理60 min和1.0%的次氯酸钠溶液处理40 min能最有效地促进彩云兜兰成熟种子的萌发。
2.3 基本培养基对种子萌发的影响
兜兰种子萌发和随后的原球茎发育和生长明显地受培养基的影响,已报道使用的基本培养基有Thomale GD[27] 、Gurgeff EG-1[28]、Norstog[28]、RE [29,30]、MS[31]、1/2MS、1/4MS、1/5MS、KC和MKC[3, 32]、VW[33]、BM和BM1[33]、N培养基[33]、花宝培养基[8, 15, 34],使用较多的为不同配比的MS培养基,但大多数种类需要较低盐浓度,高盐浓度的MS培养基上常起抑制作用,而1/2、1/4、1/5或1/8 MS较为合适[8-10, 20, 35-38]。在早期兜兰播种研究中,较多采用Gurgeff EG-1和Thomale GD培养基[27-28, 38-42]。Flamee[27]报道兜兰杂交种在改良的Thomale（Thomale GD8）培养基上在光下培养比Burgeff N3f的萌发效果好。Nhut等[19]报道授粉后9个月的德氏兜兰在Knudson KC培养基上的培养效果比MS或者1/2 MS培养基好。Pierik等[35]报道缘毛兜兰（P. ciliolare）在KC和1/4 MS培养基上的萌发效果比MS好,但随后植株在KC上生长时会死亡,而改良的Thomale GD培养基比1/4 MS培养基上更有利于原球茎的发育和幼苗生长。另外,同一种类最理想的培养基在不同的实验中表现出不一致性。陈之林等[9]报道,RE培养基比MS、1/2MS、KC和Hyponex培养基更适合于杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子萌发;而丁长春等[10]报道,1/5MS培养基比RE、1/2MS、1/10MS、KC和Hyponex培养基更适合于杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子萌发。陈羡德等[37]报道1/2MS比1/4MS、3/4MS和MS更适合魔帝类兜兰的无菌播种。Tay等[38]报道,苏氏兜兰（P. sukhakulii）及其杂交种在Norstog和Burgeff EG-1培养基上都有较好的萌发效果,但Burgeff EG-1更适合随后的原球茎分化和幼苗生长。这两种培养基的区别在于含有不同的氮源,Burgeff EG-1的氮源是氨盐,而Norstog培养基则是氨基酸。Zeng等[15]报道彩云兜兰在VW培养基上萌发率最高,但在H026培养基上成苗率最高。
2.4 有机添加物和活性炭对种子萌发的影响
有机添加物对兰花种子萌发和原球茎发育一般都具有促进作用,但有些却起抑制作用。有机添加物包括椰子汁、香蕉汁、苹果汁,蛋白胨、水解酪蛋白和胰蛋白等[43]。在兜兰种子萌发的研究中也表现出不一致的结果[1, 15, 20, 35, 44]。Curtis [44]在培养基中加入蛋白胨能使波瓣兜兰（P. insigne）和带叶兜兰（P. hirsutissimum）的萌发率提高大约30%。Pierik等[35]报道,胰蛋白是缘毛兜兰种子萌发所必需的,而香蕉汁对种子萌发起轻微的抑制作用。Long等[20]在培养基中加入10%的椰子汁,紫毛兜兰（P. villosum）的萌发率最高,可达10%;加入苹果汁或土豆汁时,萌发率低于3%;而加入佛手瓜汁或水解乳蛋白时,种子不萌发。椰子汁对种子萌发的促进作用可能是椰子汁中含有氨基酸、维生素、糖类物质和植物生长调节剂等[8, 45],也可能是椰子汁中含有各种各样的无机离子如磷、镁、钾和钠等[46]。陈之林等[9]在培养基中加入20%的椰子汁,兜兰种子萌发的后期成苗中会出现一胚多苗的现象,这可能与椰乳中含丰富的植物生长调节剂有关。香蕉汁的抑制作用可能是由于在培养基加入高浓度的香蕉汁造成糖或其他营养物质浓度过高而抑制兜兰种子萌发,但它对兜兰的小苗生长有利。
2.5 植物生长调节剂对种子萌发的影响
2.6 培养方式和pH值对种子萌发的影响
在兜兰种子萌发中,培养基的pH值在5.0~6.0之间。Pierik等[35]报道缘毛兜兰（P. ciliolare）在pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0 的培养基上种子的萌发率没有明显的差异,但原球茎的进一步发育时,在两个较高的pH值下明显受到抑制。
2.7 糖源和活性炭对种子萌发的影响
糖类物质作为培养基的能源物质和渗透调节剂,对兜兰种子萌发和原球茎的生长影响较大,培养基中没有糖源时,种子不能萌发[28, 35]。糖源的种类和浓度对兜兰种子的影响不同。Long等[20]在培养基中加入20 g/L葡萄糖时,紫毛兜兰的种子萌发率为19%,加入相同浓度的蔗糖时,种子萌发率约为9.8%,而加入麦芽糖或甘露醇时仅为2.5%和0.08%。Pierik等[35]在培养基中加入0.5%葡萄糖和0.5%果糖时,缘毛兜兰种子的萌发率达到48%;在加入1%葡萄糖和1%果糖时,种子的萌发率仅为37%;在加入1.25%葡萄糖和1.25%果糖时,种子的萌发率仅为29%;在加入0.75%葡萄糖和0.75%果糖时,种子的萌发率为41%。
2.8 光照对其萌发的影响
光照条件对种子萌发影响较大。通常认为附生兰需要光照,而地生兰需要黑暗培养诱导种子发芽,但实际上,兰花种子对光周期的反应因种类而异,与它是附生兰或地生兰无关。Stimart等[42]报道,在Burgeff EG-1、Thomale GD、KC和Norstog四种培养基中,Burgeff EG-1适合于兜兰种子在光下的萌发和随后的幼苗生长;Thomale GD适合于兜兰种子在黑暗下的萌发和随后的幼苗生长。Tay等[38]报道苏氏兜兰和其杂交种在Norstog培养中于黑暗条件下培养6周或更长时间有利于种子萌发和原球茎的发育,在此培养基上,在光下培养,大部分原球茎或变褐或死亡;然而幼苗在Burgeff EG-1培养基上在光照条件下最适合于它的生长。Zeng等[15]报道先黑暗培养30~ 45 d再在每天16 h光照培养,比全黑暗培养或仅在16 h光照培养时,萌发率显著提高。Norstog培养基中的氨基酸促进兜兰种子的萌发和原球茎的生长,但抑制其他一些兰花如杓兰（Cypripedium reginae）幼苗的形成[50]。在Norstog培养基中光抑制的产生可能是在光下氨基酸的利用受到抑制。Pierik等[35]报道,缘毛兜兰在0~ 3.0 W/m2的光密度下,随着光照的增强,萌发率逐步降低,但光照有利于植株的生长。陈之林等[9]报道杏黄兜兰和硬叶兜兰经历3周的暗培养有利于提高其种子萌发率。
3 组织培养研究进展
3.1 外植体的选择
在采用试管外兜兰材料组织培养的外植体利用方面,由于外植体的去污难度大（如采用茎尖做外植体时,即便是种植在温室中的兜兰,通过常规消毒仍大量地被细菌、真菌、病毒和其他病原菌感染）或由于外植体诱导的效率较低而较少报道[1, 63-65]。1975年Stewart等[63]分别利用室外3个兜兰品种的年幼花茎、成熟花茎、叶尖、根尖、雄蕊、子房和顶芽诱导愈伤组织,结果发现只有顶芽能产生愈伤组织。在顶芽培养中,126个外植体,仅29个没被污染。且顶芽形成的愈伤组织数量很少,在继代培养的过程中,也仅有少量愈伤组织没有分化成苗。Huang等[55]通过采用2~ 3 mm的茎尖生长点为外植体时,能有效提高消毒的成功率,但由于外植体过小,外植体的启动生长的速度慢,也易死亡。杨燕萍等[64]在常规消毒亨利兜兰茎尖后,发现用0.1%克拉霉素浸泡5 min能较有效地减少内生菌的污染率。Liao等[66]利用兜兰杂交种P. Deperle和P. Armeni White的花茎横切片诱导出了不定芽,并再生了完整植株。
3.2 基本培养基
3.3 植株再生的方式
进行兜兰组织培养时,主要有愈伤组织或类原球茎诱导再生途径和丛生芽再生途径两种方式[1],Lin等[59]采用兜兰杂交种P. callosum ‘Oakhi’×P. lawrenceanum ‘Tradition’种子萌发而来的原球茎在1/2MS添加1~10 mg/L 2,4-D和0.1~1 mg/L TDZ上能形成愈伤组织,单独使用TDZ未能诱导出愈伤组织,单独使用2,4-D时诱导率低。愈伤组织在1/2MS附加5 mg/L 2,4-D和1 mg/L TDZ能增殖。增长倍率可达2.24。愈伤组织在1/2MS附加0.1 mg/L NAA和0.5 mg/L TDZ上能形成类原球茎,分化出再生芽,形成完整株。
兜兰在组织培养过程中,可以通过不定芽增殖进行快速繁殖。一些兜兰采用茎尖或茎节培养能直接诱导不定芽并生根成苗[56, 58, 61, 65]。Huang等[65]报道100 mg/L BA可以促进兜兰杂交种（P. philippinense × P. Susan Booth）侧芽的产生,而100 mg/L BA对大多数植物是有毒性的。Huang等[55]报道,在3种兜兰杂交种（P. philippinense × P. Susan Booth; P. bellatulum ‘Big spot’ × P. Jo Ann’s Wine; P. micranthum × P. glaucophyllum）不定芽增殖和生根同时进行的研究中,BA比TDZ更加有效。陈宝玲等[69]报道丛生芽在1/2MS附加3.0 mg/L 2,4-D 和0.1 mg/L TDZ上增殖效果好,培养90 d时增殖倍数可达2.2。Hong等[67]报道P. Alma Gavaert单个不定芽60 d最多能诱导出3个新的不定芽。杨燕萍等[64]报道,以茎尖为外植体时,丛生芽诱导培养基以Heller+6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L最佳,继代培养中,1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 2 mg/L+10%椰子汁+ AC 2 g/L的效果较好,丛生芽增殖倍数为3.50。壮苗生根以1/2MS+NAA 1.0 mg/L+10%土豆汁+ AC 2 g/L为好。Long等[20]以播种获得的3~ 4 cm高的小苗或其茎节为材料,同一材料在不同的细胞分裂素和生长素的组合条件下除了新芽数目不一样以外,新芽的长度也存在显著差异;不同的材料对细胞分裂素和生长素的敏感性不一样,BA达到4 mg/L时,波瓣兜兰的芽褐化,杏黄兜兰茎节的新芽最多、最长。Nhut等[57]报道单个茎节再生成不定芽的百分率最高为75%。Luan等[68]在室外调节光源使得茎长长后,取茎节无菌消毒,污染率为37.50%~52.50%,不定芽再生率最高为33.50%。此外,有2篇文献报道通过破坏不定芽的生长点（茎尖）,可促进不定芽的增殖[19, 70]。
3.4 植物生长调节剂对成苗的影响
目前常使用的外源激素主要是生长素（2,4-D和NAA等）和细胞分裂素类（BA、ZT和KT等）。Nhut等[57]在进行德氏兜兰茎节培养时,BA浓度为2.0 mg/L时,具有最高的不定芽形成率（54.5%）,且芽较小,而使用1.5 mg/L的Zeatin或TDZ时,芽较大,诱导率分别是58.3%和75%。Ng等[58]利用若氏兜兰无菌播种苗的茎节为外植体,在1/2MS培养基上以不同浓度的BA和KT进行类原球茎的诱导时,4.0 µmol/L KT的诱导效果最好,每个外植体在培养8周后能形成4.1个类原球茎（PLBs）。Chen等[62]报道,2,4-D对兜兰茎节不定芽的诱导有一定的促进作用,其浓度以1.0 mg/L效果较好。在菲律宾兜兰（P. philippinense）的2个杂交种——PH59和PH60中,PH59在1/2MS培养基上附加1.0 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L TDZ组合时效果比单独使用1.0 mg/L 2,4-D或0.1 mg/L TDZ时好。在无激素的1/2MS培养基上,PH59有33.3%形成了芽,而PH60无不定芽的生成。杂种PH60在使用0.1 mg/L TDZ时能获得较高的不定芽诱导率。Huang等[55]报道,利用3个兜兰的杂交种试管苗的茎尖为外植体时,在MS培养基附加3.0 mg/L BA、0.3 mg/L NAA、60 g/L硫酸腺嘌呤、1700 mg/L磷酸二氢钠和15%的椰子汁时能较好地一次成苗。在BA的浓度分别为3、9、27、100 mg/L时,BA浓度对不定芽的诱导和生根的影响不大,但高浓度时对根的诱导表现出抑制作用。TDZ浓度（0.003、0.03、0.3 mg/L）在初代培养时对不定芽的增殖和生根没有明显影响,但继代培养时则对不定芽诱导表现出抑制作用,且浓度越高,抑制作用越强;除在第3代时低浓度（0.003 mg/L）的TDZ可明显促进生根外,TDZ多表现为抑制生根,浓度越高,抑制作用越强。NAA对不定芽的生长影响不大,但在较高浓度（超过1.0 mg/L）时对不定芽的生成有轻微的抑制作用。对根的诱导在较高浓度（0.3 mg/L和1.0 mg/L）时比较低浓度（0.03 mg/L）的效果好。Chen等[61]分别采用未切割的1.5 cm完整叶和0.5 cm的叶片切块作为叶片外植体,完整叶片和叶片切块的不定芽诱导率、出芽个数与叶片的培养方式、植物生长调节剂浓度及兜兰品种有关,其中植物生长调节剂多表现出抑制作用。叶片未切割时,在1/2MS培养基上PH59、PH60均有25%的外植体分化出芽,添加植物生长调节剂时,1.0 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L TDZ能促进PH59不定芽的形成,1.0 mg/L 2,4-D、5.0 mg/L TDZ、1.0 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L TDZ能促进PH60不定芽的生成。切割叶片时,PH60只在1/2MS+ 1.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L TDZ诱导出了丛生芽,而其他所有植物生长调节剂及其组合均表现出一定的抑制作用;而PH59在1.0 mg/L TDZ时尽管出芽的叶片数减少,但每个叶片的平均出芽数增多,可达7.0个,而对照为5.6个。Hong等[67]报道,摩帝类兜兰（Paphiopedilum Alma Gavaert）的种子在1/2MS培养基附加6.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L TDZ时,在黑暗培养中诱导有分化能力的愈伤组织,愈伤组织在1/2MS培养基附加6.0 mg/L NAA时能形成类原球茎,继而分化成芽并形成小植株;而1/2MS培养基附加1.0 mg/L KT时有利于丛生芽的增殖。Nhut等[19]报道采用损伤和液体培养的方法,德氏兜兰幼苗在MS培养基补充1.0 mg/L TDZ时,每个损伤的叶片能形成5个丛生芽。
3.5 糖源对成苗的影响
糖类物质作为培养基的能源物质和渗透调节剂,对原球茎的生长影响较大,不同种类的糖源及其浓度对兰花组培的作用不同。在兜兰的组织培养中,蔗糖的效果比麦芽糖好,浓度以30 g/L的效果最好[55]。
3.6 有机添加物对成苗的影响
4 共生萌发研究进展
大部分兰科植物的种子非常微小,无胚乳,呈粉尘状,在自然状态下需要和真菌共生才能萌发。在植物无菌播种和组织培养技术发明之前,兰科植物的有性繁殖常采用在原生地的土壤中播种进行繁殖或采取带有兰科植物原生地共生真菌的土壤在实验室进行播种繁殖[71,72,73,74]。共生真菌在兰科植物的种子萌发中起到了关键作用,根据目前已有的研究结果,促进兰花种子萌发的真菌具有专一性[7]。Khamchatra等[5]报道从紫毛兜兰根中分离得到真菌PVCP01（Tulasnella sp.）能促进其种子萌发和随后各阶段的生长,而PVCP05（Ceratobasidium sp.）和PVCP06（Flavodon sp.）仅能促进种子萌发及发育到第二期。在离体培养成苗时,共生真菌也具有宿主专一性,如朱鑫敏等[75]等从硬叶兜兰和杏黄兜兰根中分别分离得到瘤菌根菌属（Epulorhiza）真菌PM-1和美孢胶膜菌（Tulasnella calospora）PA-1。在营养相对贫瘠的DE培养基上,PM-1和PA-1分别与硬叶兜兰和杏黄兜兰共培养时,PM-1能促进2种兜兰生长;PA-1对2种兜兰生长的影响不显著,但真菌对宿主植物生长的促进作用更强。PM-1和PA-1在营养丰富的Harvais培养基上与硬叶兜兰和杏黄兜兰共培养时不利于共生。
为了获得兰科植物种子萌发阶段的共生真菌,Rasmussen等[76]发明了兰科植物种子原地共生萌发技术（in situ seed baiting technique）,他们将兰花种子装入能透过水和微生物但不能透出种子的尼龙膜制成的袋子中,埋于兰科植物原生境,一段时间后,能从萌发的原球茎或小幼苗中分离得到共生真菌。在国际上,该项技术已成为兰科菌根真菌研究及兰花保育中的一项常用技术,并通过该技术获得了一系列能促进兰科种子萌发的共生真菌[77]。有关促进兜兰种子萌发的共生真菌研究较少,孙晓颖等[6]采用原地共生萌发技术从2株自然萌发的带叶兜兰小幼苗中,分离和筛选出了能促进种子萌发的共生真菌——瘤菌根菌（Epulorhiza sp.）,利用该共生菌与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验时发现,接菌的种子平均萌发率为58.35%,而对照组没有种子萌发。Yang等[7]利用原生地的土壤作萌发基质,在实验室利用非原地共生萌发技术（ex situ seed baiting technique）,从白旗兜兰中分离到能促进种子萌发的2株胶膜菌科（Tulasnellaceae）共生真菌GYBQ01和GYBQ02,利用这2株真菌和白旗兜兰进行共生培养时,萌发率分别为34.9%和50.8%,而对照及采用从竹叶兰中分离的共生菌则不能促进白旗兜兰的种子萌发。
5 试管苗的移栽研究进展
兜兰在出瓶前一般要在栽培温室中炼苗2周,移栽后需保持较高的空气湿度[9]。栽培基质多采用火山石、树皮、泥炭土、泥炭藓等及其混合基质[1]。陈宝玲等[78]使用腐熟过的碎树皮做基质时,带叶兜兰试管苗移栽成活率均达99.7%以上。紫毛兜兰在泥炭藓基质中成活率为60%[20],Ng等[56]报道国王兜兰移栽至泥炭藓基质中,成活率为90%;Chen等[61,62]利用泥炭藓做基质,菲律宾兜兰杂交种的试管苗成活率可达100%。陈之林等[9]报道硬叶兜兰和杏黄兜兰在植金石和火山石的混合基质中移栽成活率可达70%以上;带叶兜兰在树皮和火山石的混合基质中,成活率可达75%以上[79];Zeng等[15, 66]报道采用植金石、泥炭土和树皮（体积比2:1:1）时,彩云兜兰的移栽成活率可达95%,汉氏兜兰可达88.5%。Zhang等[16]报道杏黄兜兰试管苗在泥炭藓作为基质时移栽成活率最高,达90.7%;植金石为89.3%,泥炭土为79.0%,兰石为73.0%,植金石、泥炭土和树皮混合基质（体积比2:1:1）为86.0%,兰石、泥炭土和树皮混合基质（体积比2:1:1）为79.3%,植金石、椰壳和树皮混合基质（体积比2:1:1）为85%。
6 问题与展望
尽管已有大量兜兰离体繁殖技术研究的报道,但主要集中在原生种的无菌播种以及以试管内由种子萌发而来的原球茎或小苗进行组织培养,而以温室内材料为外植体进行组织培养和共生萌发的研究较少。兜兰原生种无菌播种技术的成功,能繁殖大量的试管苗用于迁地保护和自然回归且满足原生种市场的需要。无论如何,共生真菌是影响兰科植物种子萌发、地理分布和生存的主要因素,回归到自然界的兜兰如果采用共生萌发技术获得,或在无菌萌发成苗后再进行共生菌的接种形成菌根会有利于回归到自然界的兰花的生存和世代更新,但目前对兰科植物在萌发和生长阶段是否存在专一性没有定论,其共生的机制也不完全清楚,通过兰科植物种子原地共生萌发技术有助于了解有益真菌的分布以及自然界中真菌与兰科植物的专一性。
杂交种通过播种繁殖时,其后代性状不一致,特别是摩帝类兜兰花期完全不一致,严重地制约了它的产业化推广。采用兜兰优良株系的营养器官为外植体进行组织培养时,存在外植体去污染难、增殖系数低、生产速度慢等问题。中国科学院华南植物园科研团队对兜兰组织培养技术进行了长期研究,通过在温室中先喷施杀菌剂培养一段时间,能较有效地抑制内生菌从而减少外植体的接种污染率,通过培养基和培养条件的优化,已能以温室中优良摩帝类兜兰的侧芽为外植体,进行种苗的规模化生产,获得成功的品系已有10多个,相关成果已在中国和日本获得了专利保护权,目前正在熟化相关技术进行种苗的规模化生产,已获得了遗传背景一致的优质杂交兜兰种苗,利用这些种苗能进行有效的花期调控研究,使其应节开花,能提高产品的附加值。但大部分种类的组织培养增殖速度较慢,难以进行商品化生产,影响其繁殖速度的遗传机制尚不清楚,需要进行深入研究,只有大部分优良兜兰品种能利用组织培养进行规模化生产时,兜兰产业才能进入快速发展的轨道。