荔枝（Litchi chinesis Sonn.）为无患子科荔枝属植物,是我国大宗的热带、亚热带果树,经济栽培主要分布在广东、广西、福建、云南、海南和台湾等省区,近10年栽培面积稳定在58万hm2左右（占全球80万hm2的72.5%）,但产量呈增加趋势,2018年我国荔枝产量首次突破300万t,占全球荔枝总产量的70%[1]。荔枝是典型的具假种皮果实,色香味俱佳,果肉（假种皮）富含各种人体所需的营养物质,是我国南方具有极高商业价值的亚热带水果,深受消费者青睐。
随着经济社会的发展,人们的消费水平逐步提高,对果实的品质要求也逐步提升。果皮颜色作为荔枝重要的商品性状之一,很大程度上影响着消费者的购买欲望。消费者往往会将成熟美味,口感清甜等特点与荔枝果皮红艳联系在一起。商业销售品种果皮色彩一般为鲜艳明亮的红色至紫红色。以‘妃子笑’为例,该荔枝品种因其丰产稳产,果大肉厚的优良品质在广东省受到大力推广,但由于果皮着色较差,成熟果实通常着色不均匀甚至不着色,导致市场上消费者的接受度下降,严重影响了果实商品性。王惠聪等[2]认为,‘妃子笑’荔枝果实着色差是因为其果皮中的叶绿素降解慢,妨碍花色苷的合成,因此,呈现明显‘滞绿’的特点。荔枝果皮的红色表色,主要是花色苷合成积累的结果。花色苷,又名花青素、花色素苷,是使植物的花、果实、种子等呈现鲜艳颜色的主要色素,同时,作为一种重要的水溶性色素,在植物处于低温、干旱、强光等逆境时,有助于提高植株抗性和适应不良环境的能力[3];另外,花色苷在改善视力、防止肥胖、保护心血管功能等营养保健方面也有巨大潜力[4]。花色苷属黄酮类化合物,基本碳骨架结构为C6-C3-C6,由糖与花色素以糖苷键结合成,常见花色素有矢车菊色素、飞燕草色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和矮牵牛花色素[5]。关于荔枝果皮花色苷的种类前人早已鉴定：张昭其等[6]通过对荔枝果皮中花青素的纯化与结构鉴定得出主要花色苷成分为矢车菊-3-芸香二糖;何会[7]对经大孔树脂纯化后的荔枝果皮花色苷样品分析发现,除含有矢车菊-3-芸香糖苷外,其余还包括矢车菊-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-芸香糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷等其他花色苷;Wei等[8]通过对6个红色荔枝品种进行了HPLC分析,发现矢车菊-3-芸香糖苷为荔枝果皮花色苷的基本组成,这与前人报道结果基本一致。
近20年来,有关荔枝果皮花色苷的生物合成及调控的研究不断深入。在外界环境方面,有研究者分别从光照、温度、矿质营养和果园管理措施等外界因素分析对荔枝果皮花色苷积累的影响[9,10,11,12]。关于影响荔枝果皮花色苷合成的内因前人也有报道,尹金华等[13]以‘妃子笑’荔枝为试材,分别从可溶性糖、PAL酶活性及pH值三方面研究相关内部因素对果皮花色苷合成的影响;魏永赞等[14]利用‘桂味’荔枝来研究植物激素对荔枝果皮花色苷合成的调控机理。在分子生物学技术飞速发展的同时,对荔枝果皮花色苷合成的调控机理也深入到分子生物学层面。本文在查阅国内外荔枝花色苷生物合成及其调控的相关文献基础上,较为系统地从外界环境层面、生理生化层面和分子生物学层面回顾了花色苷生物合成途径、影响因素及其调控机理,以期为荔枝果实色泽的遗传改良,生产上能更有效地调控荔枝果实着色,改善果皮颜色,提高荔枝果实品质提供重要的参考。
1 花色苷的生物合成途径
图1 花色苷生物合成途径PAL：苯丙氨酸解氨酶;C4H：肉桂酸-4-羟化酶;4CL：4-香豆酸-辅酶A连接酶;CHS：查尔酮合成酶;CHI：查尔酮异构酶;F3H：黄烷酮-3-羟化酶;F3°H：黄烷酮-3°-羟化酶;F3°5°H：黄烷酮-3°,5°-羟化酶;FLS：黄酮醇合成酶;DFR：二氢黄酮醇4-还原酶;ANS：花青素合成酶;ANR：花青素还原酶; UFGT：类黄酮糖基转移酶;LAR：无色花色素还原酶; 3RT：类黄酮3-O-鼠李糖基转移酶。 Fig. 1 The biosynthesis pathway of anthocyanins PAL: L-phenylalanin ammo-nialyase; C4H: Cinnamic acid-4- hydroxylase; 4CL: 4-coumarate:CoA ligase; CHS: Chalcone synthase; CHI: Chalcone isomerase; F3H: Flavanone 3-hydroxylase; F3° H: Flavonoid 3°-hydroxylase; F3°5°H: Flavonoid-3°, 5°- hydroxylase; FLS: Flavonol synthase; DFR: Dihydroflavonol 4-reductase; ANS: Anthocyanidin synthase; ANR: Anthocyanidin reductase; UFGT: UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase ; LAR: Leucoanthocyanidin reductase; 3RT: Flavonoid -3-O-rhamnosyltransferase. |
2 荔枝果皮花色苷合成的基因调控
2.1 结构基因
李平等[22]提出,PAL活性与荔枝果皮花色苷合成无关,进一步分析其他合成酶活性与花色苷积累的关系发现,UFGT酶的活性与荔枝果皮花色苷合成密切相关[23]。UGFT酶是葡萄糖基转移酶,催化花色苷合成最后一步,是花色苷稳定性和水溶性的关键一步[24]。研究者发现,UFGT基因的表达对葡萄果实中花青素的生物合成至关重要,通过对白、红两个品种果实果皮的检测,发现只有红葡萄中才有UFGT基因表达,而白葡萄中无UFGT基因表达[25,26]。在荔枝的研究方面,通过对荔枝果皮花色苷合成酶的结构基因进行克隆和在不同的荔枝品种的差异表达分析,发现LcF3H至LcUFGT的后期结构基因的表达与花色苷含量呈正相关,其中果皮中花色苷和类黄酮的含量与LcUFGT的表达呈显著关系[8, 27-28]。随着进一步研究,在荔枝果皮中分离出LcUFGT1-4四个UGFT基因成员,最后证实只有LcUFGT1能以花青素为底物,LcUFGT1在荔枝果皮的红色形成中起着关键作用[18]。可见UFGT基因在荔枝果皮花色苷生物合成中不可缺少。
在花色苷合成途径中存在生成黄酮醇与原花青素支路,前者由黄酮醇合成酶（FLS,Flavonols synthetase）催化合成,后者由无色花青素还原酶（LAR,Leucoanthocyanidin reductase）、花青素还原酶（ANR,Anthocyanidin reductase）催化合成。在花色苷合成途径中,原花青素的合成具有竞争性：缺乏ANR的拟南芥其花青素含量增加[31];烟草中LAR基因和ANR基因的过表达会导致原花青素含量增加,花青素含量减少[32];荔枝果实成熟过程中果皮花色苷逐渐增加,而原花色苷逐渐减少,且荔枝果皮中LAR基因和ANR基因在果实发育前期表达量更高[33],因此,原花色苷含量调控荔枝果皮花色苷的合成可能通过LAR基因和ANR基因发挥影响。
2.2 调控基因
MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,主要分为R1/2-MYB,R2R3-MYB和R3-MYB三大类,主要负责植物体内的生物合成调控[34]。部分MYB转录因子能发挥两种作用,既能单独激活结构基因的表达,又能形成MYB- bHLH复合物进行调控[35]。从葡萄、苹果和杨梅等果实中分离出的MYB基因,在缺乏bHLH基因表达的情况下,在烟草叶片中瞬时表达时不能引起花青素积累[26, 36-37]。而荔枝的LcMYB1单独转化后在烟草过表达能够诱导内源bHLH转录因子NtAn1b的上调促使花色苷积累,且发现LcMYB1与LcUFGT的表达高度一致;LcMYB1-LcbHLH1和LcMYB1-LcbHLH3复合物可以激活DFR和ANS基因表达,与LcMYB1单独转化的烟草相比,LcMYB1-LcbHLH3在烟草中的过量表达所积累的花色苷含量更多,这说明LcMYB1-bHLH复合体通过激活花色苷生物合成的后期基因DFR和ANS的表达来调控花色苷的合成[38,39]。此外,赖彪[33]通过鉴定发现荔枝的LcMYB2与原花色苷合成基因LcANR和LcLAR的表达几乎一致,然而LcMYB2是否能诱导原花青素的合成从而调控花色苷积累还有待进一步的证明。近期研究鉴定了一种新的荔枝R2R3-MYB转录因子—LcMYB5,与只在红色组织中表达的LcMYB1不同,LcMYB5是组成型表达基因,在大多数组织或器官中表达,通过直接激活CHI、F3H、DFR等结构基因的表达或间接上调内源性bHLH调节因子的表达来参与花色苷积累的调控,LcMYB5还可能与LcbHLH1相互作用调控荔枝细胞酸性相关的关键基因的表达[40];陈霖欢[41]通过克隆得到4个荔枝MYB类花色苷生物合成负调控基因,分别为LcMYBC2-L1、LcMYBC2-L2、LcMYB4和LCMYBx,通过构建基因表达载体后发现,LcMYBC2-L1和LCMYBx明显抑制花色苷的合成,其中LCMYBx对花色苷合成相关结构基因和调控基因有明显抑制作用。
除了MYB、bHLH和WD40三大类转录因子家族外,其他转录因子和调控基因也会影响花色苷的生物合成。microRNAs（miRNAs）是一类非编码小分子RNA,SQUAMOSA PROMOTERBINDING PROTEIN-LIKE（SPL）是一种负转录因子,前者在转录后水平上调控靶基因表达,增强植物对胁迫的抵抗能力[42],后者是前者的其中一个靶标基因。在拟南芥中,SPL9在miR156调控下表达,通过干扰MYB-bHLH-WD40转录复合物的完整性对花青素合成起负调控作用[43]。在研究荔枝果皮花色苷合成的转录后调控过程中,miR156a和新型microRNA（NEW41）分别靶向LcSPL1/2转录因子和LcCHI基因,其中,LcSPL1通过与LcMYB1的相互作用而负调控花色苷的生物合成,LcMYB1在之前已被证实是荔枝果皮花色苷合成的关键基因[38, 44]。NAC转录因子主要参与调控植物成熟衰老过程和抵抗逆境的能力,研究发现,NAC转录因子与MBW复合物的相互作用形成了调节花色苷生成的一种调控途径[45,46]。在荔枝的相关研究中,LcNAC13直接与花色苷生物合成相关基因的启动子结合,包括LcCHS、LcCHI、LcF3H、LcF3'H、LcDFR和LcMYB1,并抑制它们的转录;一个新分离出来的R1-MYB转录因子- LcR1MYB1,作为LcNAC13的阻遏物逆转其对花色苷生物合成的抑制作用[47]。以上结果说明荔枝果实除了以MYB为中心调节花色苷合成的机制外,其他转录因子也可能直接参与花色苷合成的转录调节。
3 影响荔枝果皮花色苷合成内外因素
3.1 光照
光照是影响花色苷生物合成的主要环境因素,植物对光的反应由4种不同类型的光受体介导：光敏色素（Phytochromes, PHYs）、向光素（Phototropins,PHOTs）、隐花色素（Cryptochromes, CRYs）和UVR8。COP1（Constitutive photomorphogenic 1）蛋白是光信号转导中一种重要的负调控因子,一般认为,光受体通过识别并传递不同的光信号,直接或间接影响相关基因表达[48,49]。早有研究报道套袋使内源激素ABA水平升高,GA1/3水平降低来调节果皮花色苷合成,从而促进‘妃子笑’荔枝果实着色[50,51]。通过研究初步得到光对荔枝果皮花色苷合成的影响机制：解除遮光后,荔枝果皮中的4种光受体转录水平显著增加,其中UVR8s表达量最高,认为UVR8可能是荔枝果皮中最重要的光感受器,紫外线（UV-B）对荔枝果皮着色效果最强;同时,随着COP1和COP10的转录水平逐渐降低,几乎所有参与花色苷生物合成的结构基因和调控基因表达均上调,从而使花色苷含量增加,这2个光信号转导元件可能参与了花色苷的生物合成调控[9, 52]。光调节花色苷生物合成的简化模型如图2所示。
图2 光调节花色苷生物合成的简化模型（参照Zhang等[52]并稍作修改）PHYs：光敏色素;PHOTs：向光素;CRYs：隐花色素; UVR8：抗紫外基因座8;COP1：组成型光形态1; HY5：伸展的下胚轴5。 Fig. 2 Simplify model of the regulation role on anthocyanin biosynthesis (Refering to Zhang et al.[52] with slight modification) PHYs: Phytochromes; PHOTs: Phototropins; CRYs: Cryptochromes; UVR8: UV Resistance Locus 8; COP1: Constitutive photomorphogenic 1; HY5: Elongated hypocotyl 5. |
3.2 温度
3.3 矿质营养
不同矿质元素对果实着色影响不同,不同的施肥技术也会对果实着色产生不同效果,常见矿质元素如N、P、K、Ca、Mg等对荔枝果皮着色具有重要作用。N、P是植物细胞中许多重要化合物的组成成分,其中,N是叶绿素组成成分,在植物生理反应中起调节作用,研究表明,植物在N、P水平低时显示出低含量的叶绿素和高含量的花色苷[60]。在荔枝研究方面,周开兵等[61]通过叶面喷施P、K和Ca肥发现可以促进‘三月红’荔枝果皮着色;张锐[62]以‘三月红’‘白糖罂’分析果实发育中营养元素含量与果皮着色关系,发现果皮色素含量与果皮总钙含量密切相关,其中与花色苷含量呈正相关,与叶绿素含量呈负相关,说明果皮Ca是影响果皮红色发育的关键营养素;苏阳[11]通过比较荔枝着色不良品种和着色良好品种之间K、Ca、Mg含量的变化,发现全Ca含量与果皮内源激素含量具有显著相关性,而此前已有研究报道,激素是调节荔枝果皮花色苷代谢相关酶活性的重要因素[24];高丹[63]在此基础上进一步得出结论,矿质元素可能是通过影响荔枝果皮内源激素含量,如脱落酸和乙烯,进而提高花色苷合成酶UFGT和叶绿素降解PAO（脱镁叶绿酸a氧化酶）的活性,最终促进荔枝果皮表现为红色。
3.4 植物激素
果实花色苷合成受多种植物激素影响,不同植物激素可单独或共同调控果实花色苷的合成相关基因的表达[64]。分析荔枝果皮花色苷与内源激素含量之间的关系发现,在果实成熟后期,ABA含量增加并诱导乙烯生成启动果实成熟,花色苷迅速合成使果皮转为红色[51, 65]。LcMYB1是荔枝果皮花色苷合成的关键基因,能受多种植物激素调控,通过对其进行启动子序列分析发现具有多种激素应答元件,包括生长激素应答元件（TGA）、脱落酸应答元件（ABRE）、赤霉素应答元件（GARE）[38]。Wei等[8]通过对‘妃子笑’喷施ABA和CPPU发现,ABA通过增加LcUFGT的表达量来促进花色苷的积累,CPPU可能通过拮抗ABA影响花色苷的合成。为了进一步了解ABA对荔枝果实着色的影响机制,Hu等[66]在荔枝中分离出3个ABA响应元件结合蛋白,分别为LcABF1、LcABF2和LcABF3,分析发现LcABF1通过激活荔枝中与叶绿素降解相关的基因表达来诱导叶绿素降解;LcABF3能够直接调节结构基因和调控基因的表达;LcABF2也参与叶绿素降解,但只能激活LcF3°H和LcDFR的表达,因此其在花色苷生物合成中的作用需要进一步验证。
3.5 其他因素
除上述影响因子外,pH和糖含量也可以调控荔枝果皮花色苷的合成。由于不同花色苷的结构差异,在不同酸碱条件下能显示不同颜色,酸性条件可促进花色苷的合成[67]。糖是植物花色苷合成的原料,可溶性糖含量高低影响花色苷的生物合成。雷鸣[68]对‘红地球’葡萄分别用葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖处理发现所有处理均使果实中花色苷的积累增加。尹金华等[13]、庞学群等[10]、王家保等[69]对荔枝果皮花色苷合成相关因素分析发现,pH通过影响花色苷的稳定性来调节花色苷积累,在酸性条件下花色苷结构更稳定,其中在pH值为3.0~4.0的范围能表现出较好的红色,并且,花色苷随着pH值的增加降解加快;而在不同品种中,糖含量变化规律不同,糖含量对花色苷含量的影响也不同,因此糖对荔枝果皮花色苷合成的调控机制还待明确。
4 研究展望
近年来,荔枝果皮花色苷的合成与调控研究取得较大的进展,克隆并验证许多相关结构基因和调控基因的功能;光照、矿质营养、植物激素等影响因子对花色苷合成的影响机制已初步明确。今后研究应注重以下两方面的研究开发：一是进一步研究荔枝果皮花色苷转录水平调控,以MYB为中心分析其他转录因子对花色苷的调控机制;二是明确各因子对荔枝果皮花色苷合成的综合调控路径,筛选出能够提高花色苷含量或稳定其结构,提升荔枝果实色泽的农艺措施。