烯酰吗啉（Dimethomorph）[1],是专一杀卵菌纲真菌杀菌剂,其作用特点是破坏细胞壁膜的形成[2,3],对卵菌生活史的各个阶段都有作用[4,5,6]。赤霉素（Gibberellin A3）[7],一种植物体内普遍存在促进植物生长发育重要的内源激素,工业品为白色结晶粉末[8],难溶于水、苯等,可溶于甲醇、乙醇、丙酮等[9,10]。赤霉素应用范围广泛,并且价格低廉,被认为是一种发展前景广阔的植物生长促进剂,在害虫以及抗性农业害虫的防治中广泛应用[11,12,13]。
国内外文献报道,刘磊等[1]采用超高效液相色谱-串联质谱法对辣椒及其栽培土壤中烯酰吗啉和唑嘧菌胺的残留,进行了研究,方法检出限为0.01 mg/kg;赵民娟等[3]采用高效液相色谱串联质谱法测定黄瓜与土壤中烯酰吗啉和氰霜唑及其代谢物的残留量,检出限为0.05 mg/kg,师真等[4]采用高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中13种氨基甲酸酯类农药和杀菌剂残留,检出限为0.001 mg/kg;张倩等[13]采用HPLC-MS/MS法测定设施甜樱桃果实中的赤霉素含量;李伟等采用超高效液相色谱-串联质谱法测定松花粉中赤霉素的含量,都未报道方法的检出限[14,15,16]。目前,这一类文献报道,局限于采用高效液相色谱-串联质谱法对蔬果中的烯酰吗啉或赤霉素的一种药物进行分析检测,还未见采用高效液相色谱法同时检测水果中烯酰吗啉和赤霉素残留的报道。
本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时对水果与蔬菜中烯酰吗啉和赤霉素农药残留进行定性、定量研究,分别对水果与蔬菜中烯酰吗啉和赤霉素的检出限进行了研究,2种药物在蔬果中的检出限低于国家残留限量的要求。建立了高效、灵敏、可靠的HPLC法同时测定水果与蔬菜中烯酰吗啉和赤霉素农药残留的快速分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 草莓、西瓜和西红柿样品,购于湛江本地农贸市场。甲醇、甲酸、乙腈和乙酸铵（色谱纯）,美国Fisher Scientic公司;甲醇、乙腈、正己烷、丙酮与乙酸乙酯等均为分析纯,广州化学试剂厂;水为超纯水;弗洛里矽硅土固相萃取柱,美国安捷伦公司。
烯酰吗啉与赤霉素对照品[含量(98.0± 0.2)%],德国DR Ehrenstorfer公司。
1.1.2 仪器与设备 Waters 2695型高效液相色谱仪,配备有紫外检测器,美国Waters公司;UNIVERAL 32R离心机,德国Hettich公司。
1.2 方法
1.2.1 样品制备 按照食品安全国家标准GB 2763-2016的要求,将草莓、西瓜和西红柿样品,切碎,充分混匀,放入破壁机中匀浆。匀浆好的样品,放入聚乙烯瓶中于-16 ~ -20 ℃条件下保存。
1.2.2 样品提取 称取制备好的蔬菜、水果（草莓、西瓜和西红柿）试样10 g（精确到0.01 g）,置于50 mL离心管中。加入5 mL水（2 mol/L盐酸调pH至2.5）,涡旋,混匀;加入15 mL酸性环境（pH 2.5）中的乙酸乙酯,涡旋,2 min;振荡,10 min;4 ℃,8000 r/min离心,提取有机相于50 mL离心管中;再加入15 mL酸性环境（pH 2.5）中的乙酸乙酯,重复上述操作,合并两次有机相提取液于50 mL离心管中;45 ℃,旋转、浓缩至近干。
1.2.3 样品净化 将弗洛里矽硅土固相萃取柱依次用5 mL丙酮-正己烷（10∶90,V/V）、5 mL正己烷预淋洗,条件化,当溶剂液面到达柱吸附层表面时,立即倒入上述待净化溶液,用15 mL刻度离心管接收洗脱液,用5 mL丙酮-正己烷（10∶90,V/V）冲洗烧杯后淋洗弗洛里矽硅土固相萃取柱,并重复一次。将盛有淋洗液的离心管置于氮吹仪上,45 ℃水浴条件下,氮气吹干,用超纯水定容至1.0 mL,在旋涡混合器上混匀,经0.22 μm滤膜过滤,供液相色谱测定。
1.2.4 标准溶液配制 （1）烯酰吗啉标准储备液：准确称取10.0 mg烯酰吗啉标准品,甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相当于含赤霉素1.00 mg。
（2）赤霉素标准储备液：准确称取10.0 mg赤霉素,甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相当于含烯酰吗啉1.00 mg。
（3）混合标准工作液：分别准确吸取相同体积烯酰吗啉和赤霉素标准储备液,将其稀释成烯酰吗啉和赤霉素含量分别为0.025、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的混合标准工作液。
1.2.5 高效液相色谱检测条件 色谱柱为Waters C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;流动相为甲醇（A）-水（B）-0.1%乙酸溶液（C,pH 4.0）,梯度洗脱比例见表1;流动相流速1.0 mL/min;色谱柱温度35 ℃;波长252 nm;进样量20 μL。
表1 梯度洗脱比例Tab. 1 Mobile phase gradient |
| 洗脱时间 Time/min | 流动相比例Percentage of mobile phase/% | ||
|---|---|---|---|
| A | B | C | |
| 0 | 70 | 30 | 0 |
| 4 | 70 | 30 | 0 |
| 10 | 70 | 0 | 30 |
| 16 | 70 | 30 | 0 |
2 结果与分析
2.1 样品前处理的优化
为了有效提取蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素,分别考察了提取溶剂、pH以及提取温度对于蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素回收率的影响。
2.1.1 样品提取的优化 根据烯酰吗啉与赤霉素的分子结构以及化学性质,为了有效提取蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素,采用1.2.2中样品提取的过程,分别考察了正己烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯以及酸性环境（pH 2.5）中的乙酸乙酯等不同有机溶剂作为样品提取溶剂时,水果与蔬菜中的烯酰吗啉与赤霉素的净化效果及回收率。准确称取空白水果与蔬菜样品10.0 g（精确至0.01 g）,加适量2种农药标准工作液,使加标水平为0.5 mg/kg,按1.2的方法处理后进行色谱分析。每个浓度做5 份重复,以外标法计算空白水果与蔬菜样品中农药残留量,烯酰吗啉与赤霉素在3种蔬菜与水果（草莓、西瓜和西红柿）中的回收率实验结果见表2、表3。
表2 不同溶剂提取蔬果中烯酰吗啉回收率（0.10 mg/kg, n=5）Tab. 2 Recovery rates of dimethomorph from different extracting solvents (0.10 mg/kg, n=5) |
| 提取溶剂 Extracting solvents | 回收率Recovery rates/% | ||
|---|---|---|---|
| 草莓Strawberry | 西瓜Watermelon | 西红柿Tomatoe | |
| 甲醇 | 32.3±5.6 | 23.9±2.7 | 31.2±2.6 |
| 乙腈 | 60.7±3.6 | 67.6±3.0 | 61.9±3.5 |
| 正己烷 | 30.3±5.1 | 32.6±3.2 | 31.2±4.6 |
| 乙酸乙酯 | 76.7±3.1 | 84.5±2.7 | 82.7±4.1 |
| 乙酸乙酯（pH 2.5） | 84.3±4.8 | 86.5±1.6 | 87.3±5.5 |
表3 不同溶剂提取蔬果中赤霉素回收率（0.10 mg/kg, n=5）Tab. 3 Recovery rates of gibberellin A3 from different extracting solvents (0.10 mg/kg, n=5) |
| 提取溶剂 Extracting solvents | 回收率Recovery rates/% | ||
|---|---|---|---|
| 草莓Strawberry | 西瓜Watermelon | 西红柿Tomatoes | |
| 甲醇 | 31.7±5.1 | 31.7±2.3 | 33.6±2.2 |
| 乙腈 | 55.9±1.7 | 61.5±2.3 | 51.8±2.6 |
| 正己烷 | 22.5±6.2 | 33.7±2.6 | 32.6±2.7 |
| 乙酸乙酯 | 73.5±2.9 | 80.3±1.5 | 79.9±2.3 |
| 乙酸乙酯（pH 2.5） | 82.4±6.7 | 87.6±2.0 | 91.3±2.8 |
结果表明,甲醇、乙腈与正己烷作为提取溶剂时,蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素回收率较低,难以满足残留检测要求;在酸性环境中,选用乙酸乙酯作为水果与蔬菜烯酰吗啉与赤霉素的提取溶剂时,回收率高;因此,本文选择酸性环境（pH 2.5）中的乙酸乙酯作为提取溶剂,能够有效提取蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素,且提取出来的色素杂质相对较少。
2.1.2 pH的优化 为了研究pH对提取过程的影响,采用上述相同的样品提取方法,考察提取环境pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0时,蔬菜与水果中的烯酰吗啉与赤霉素的回收率,结果见图1。结果表明,在酸性条件下（pH 2.5）,选用乙酸乙酯作为提取溶剂时,蔬菜与水果中烯酰吗啉与赤霉素的提取效率最高,方法满足回收率的要求。因此,本文选择酸性环境（pH 2.5）中的乙酸乙酯作为提取溶剂。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 紫外吸收波长的选择 由于烯酰吗啉与赤霉素的分子结构与化学性质差异,导致两种农药在液相色谱紫外吸收波长存在差异,为了在有效时间内,实现烯酰吗啉与赤霉素的分离,提升烯酰吗啉与赤霉素的灵敏度,对烯酰吗啉与赤霉素的色谱条件紫外吸收波长进行了优化。在本研究中,考察了烯酰吗啉与赤霉素在4种紫外吸收波长（210、250、252、254 nm）条件下,烯酰吗啉与赤霉素的液相色谱图像。结果表明,在紫外吸收波长252 nm处,烯酰吗啉与赤霉素的吸光度高,杂质干扰少,样品分离效果好,灵敏度高,能够满足实验的要求（图2）。因此在随后的实验中,选择252 nm作为蔬果中烯酰吗啉与赤霉素的液相色谱紫外吸收波长。
2.2.2 定容溶剂的优化 为了使烯酰吗啉与赤霉素高效液相色谱检测过程中,有效分离,同时提高2种农药的灵敏度以及色谱峰形,考察了0.1%乙酸水溶液、水、甲醇以及乙腈作为定容液时,烯酰吗啉与赤霉素的分离效果。结果表明,当选用0.1%乙酸水溶液、甲醇以及乙腈作为定容液时,目标化合物烯酰吗啉的色谱峰都能够有效分离;但赤霉素在蔬菜和水果中的色谱峰存在拖尾现象,灵敏度低,不能够满足残留检测的要求。用超纯水作为定容液时,可以显著改变目标化合物赤霉素在蔬菜和水果中色谱分离的滞留行为,得到良好的分离度和满意的峰形（图2）。
2.3 空白实验
取蔬菜与水果（不添加烯酰吗啉和赤霉素）各1份,称取10.0 g,按照1.2的方法,进行样品前处理,净化过柱后,定容,然后用高效液相色谱仪进行检测,所得的检测图谱见图3,在烯酰吗啉与赤霉素对照品的出峰保留时间5.819、6.582、8.511 min处未出现干扰峰。结果表明,蔬菜与水果样品中不含烯酰吗啉与赤霉素,不影响烯酰吗啉与赤霉素的检测。
图3 空白及加入烯酰吗啉与赤霉素（0.10 mg/kg）的蔬菜水果样品色谱图A: 空白草莓;B: 加标草莓样品;C：空白西瓜;D：加标西瓜样品;E：空白西红柿;F：加标西瓜样品。 Fig. 3 Chromatograms of blank and spiked with dimethomorph and gibberellin A3 (0.10 mg/kg) samples of vegetable and fruits A: Strawberry blank; B: Spiked strawberry; C: Watermelon blank; D: Spiked watermelon; E: Tomatoes blank; F: Spiked tomatoes. |
2.4 回收率与精密度
表4 烯酰吗啉与赤霉素两种农药的平均回收率和相对标准偏差 (n = 5)Tab. 4 Recovery rates of dimethomorph and gibberellin A3 from spiked plant and vegetable samples (n = 5) |
| 样品 Sample | 添加浓度 Spiked level/ (mg·kg-1) | 回收率Recovery rates/% | |
|---|---|---|---|
| Dimethomorph | Gibberellin A3 | ||
| 草莓 | 0.025 | 84.3±4.8 | 82.4±6.7 |
| 0.050 | 87.8±2.3 | 87.8±3.5 | |
| 0.100 | 83.2±3.1 | 83.0±1.2 | |
| 1.000 | 88.7±1.6 | 81.8±3.1 | |
| 西瓜 | 0.025 | 86.5±1.6 | 87.6±2.0 |
| 0.050 | 88.8±1.5 | 88.8±4.3 | |
| 0.100 | 82.6±2.1 | 81.2±2.2 | |
| 1.000 | 91.6±4.3 | 82.5±1.1 | |
| 西红柿 | 0.025 | 87.3±5.5 | 91.3±2.8 |
| 0.050 | 88.6±4.2 | 89.8±3.1 | |
| 0.100 | 82.2±0.2 | 85.3±0.8 | |
| 1.000 | 91.2±2.0 | 83.2±1.5 | |
2.5 方法线性与检出限
表5 方法的线性范围及标准曲线的回归方程Tab. 5 Linear range and linear equation of the method |
| 化合物 Compounds | 测定范围 Linear range/(μg·kg-1) | 线性方程 Linear regression equation | 相关系数 Correlation coefficient | 检出限 LOD/(mg·kg-1) |
|---|---|---|---|---|
| 烯酰吗啉 | 0.025~1.0 | y=1029.0x+105.2 | 0.9995 | 0.01 |
| 赤霉素 | 0.025~1.0 | y=1898.0x+148.1 | 0.9998 | 0.02 |
2.6 实际样品测定
采用本方法对来自湛江本地农贸市场的的蔬菜与水果（草莓、西瓜、生菜、西红柿、荔枝和龙眼）30个样品中2种目标物进行检测,烯酰吗啉在2个草莓样品和1个荔枝样品中被检出,检出率为10%,检出浓度最高为0.32 mg/kg,赤霉素均未检出。
3 讨论
建立了高效液相色谱法测定蔬菜与水果中2种农药的分析方法。该方法的灵敏度、精密度和检出限都能满足日常检测分析的要求,具有快速、灵敏度高的特点,适合于蔬菜与水果样品中烯酰吗啉与赤霉素药物残留的分析。运用所建立的方法对实际样品进行了检测,共检测蔬菜与水果30个批次,烯酰吗啉在2个草莓样品和1个荔枝样品中被检出,检出率为10%,检出浓度最高为0.32 mg/kg,赤霉素均未检出。
相比文献报道刘磊等采用超高效液相色谱-串联质谱法仅测定辣椒及其栽培土壤中烯酰吗啉的含量;李伟等超高效液相色谱-串联质谱法测定松花粉中赤霉素的含量;本研究更加全面、详细,采用高效液相色谱法同时测定了蔬菜与水果中烯酰吗啉与赤霉素的药物残留,烯酰吗啉与赤霉素的检出限分别为为0.01、0.02 mg/kg。该方法线性范围宽、检出限低,在实际样品的多组分测定中取得较好的效果,加标回收率在81.2%~91.3%之间,相对标准偏差均低于6.7%,表明本方法可应用于蔬菜与水果中实际样品中2种农药的高灵敏度检测,结果准确可靠。
查阅相关文献,烯酰吗啉与赤霉素的分子结构以及化学性质的差异,导致蔬菜与水果中2种农药的提取、净化以及色谱分析存在很大差别;本研究通过对蔬菜与水果前处理过程中提取溶剂以及pH值的优化,采用酸性条件下乙酸乙酯（pH 2.5）提取,蔬菜与水果中2种农药的加标回收率在81.2%~91.3%之间,满足了残留检测的要求;由于烯酰吗啉与赤霉素分子结构的差异,导致2种农药的最大紫外吸收波长存在差异,通过定容试剂、梯度洗脱以及紫外吸收波长的优化,最终在有效时间内实现了烯酰吗啉与赤霉素的有效分离,改善了色谱峰形,提高了2种农药的灵敏度,最终建立了高效液相色谱法测定蔬菜与水果中2种农药的残留方法。通过该方法的探讨与研究,为以后采用高效液相色谱法分析不同分子结构以及化学性质差异的化合物,提供了技术思路。