西番莲（Passiflora edulis Sims.）因其果汁酸甜、香味浓郁,在我国已有广泛种植,主要用于生产果汁,目前果皮尚未得到高值化利用。西番莲果皮含有丰富的膳食纤维、果胶、多酚类等功能性成分,余东等[1]测定了西番莲果皮总酚的抗氧化活性,显示其对自由基清除力与总酚含量呈量效关系,除此之外西番莲果皮含有的多糖、黄酮[2,3]类物质经验证有较好的降脂、抗炎症、抗氧化等功效。在西番莲加工过程中,提高活性成分的利用率、开发具有明确活性功能性的产品已成为关注点。酵素产品是当前果蔬加工开发热点之一,可通过发酵技术最大限度地保留果蔬中的活性成分,同时产生大量活性益生菌。酵素发酵中应用最为广泛的菌种为乳杆菌,具有抑制肠道有害菌群、改进肠道微生态的益生功能,其可在含有一定浓度的酸和酚类物质的环境中生长代谢,并且多酚类物质在乳酸菌发酵的酸性环境下更易得到保存,这对于提高酵素产品营养价值具有积极意义。已有研究表明干酪乳杆菌因具有降低人体胆固醇、降血压[4]、防治腹泻、提高免疫力[5]等作用,被越来越多地应用到酸乳、保健饮品等的生产制备中。但单一的乳酸菌发酵产品风味不足,甚至有时会产生不愉快的气味。而酵母发酵可产生大量芳香酯类物质,除了能增强发酵制品的风味外,所产生的乙醇还能抑制杂菌生长,并且对人体存在潜在的益生功能[6]。本文以西番莲果皮为主要原料,拟研究西番莲果皮酵素的酿酒酵母菌、乳酸菌发酵工艺,提高西番莲果皮的利用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 市售新鲜西番莲果皮。
1.1.2 主要试剂 脱脂乳、蔗糖、葡萄糖等（均为食用级或分析纯）,上海博奥生物科技有限公司。
1.1.3 菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei subsp. casei）,均为本实验室保藏菌种。
1.1.4 培养基 MRS琼脂培养基、酿酒酵母用培养基等,广东环凯微生物科技有限公司。
1.1.5 主要仪器 LRH生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;XK97-A菌落计数器,邦西仪器科技（上海）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 西番莲果皮酵素制备流程 菌种活化及扩大培养→菌种适应性培养→西番莲果皮浆调配→酿酒酵母菌发酵（16 h）→乳酸菌接入二次发酵（24 h）→发酵结束。
1.2.2 西番莲果皮浆发酵原液制备 灭菌的西番莲果皮浆按质量比适当补充以下物质：蔗糖5%,脱脂乳粉2%,分别进行酿酒酵母菌和复合乳杆菌的适应性培养,将扩大培养后的酿酒酵母菌按5%比例接入西番莲果皮浆进行培养,获得用于发酵的酿酒酵母菌种子液;将扩大培养后的复合乳杆菌（1∶1）按5%比例接入西番莲果皮浆进行培养,获得用于发酵的复合乳杆菌种子液。
1.2.3 酿酒酵母菌发酵单因素实验 设定酿酒酵母菌发酵温度25~33 ℃,发酵时间8~48 h,接种量为1%~3%,测定酿酒酵母菌活菌数及乙醇生成量,确定较适宜的酿酒酵母菌发酵温度、发酵时间及接种量。
1.2.4 酿酒酵母菌发酵正交优化实验 在1.2.3前提下,以发酵温度、发酵时间、酿酒酵母菌接种量3个因素设计L9(34)正交实验（表1）,以酿酒酵母菌数量和乙醇含量为评价指标,优选酿酒酵母菌发酵工艺参数。
表1 酿酒酵母菌发酵正交实验表L9(34)Tab. 1 Saccharomyces cerevisiae fermentation orthogonal test table L9(34) |
| 水平 Level | A发酵温度 Temperature/℃ | B发酵时间 Fermentation time/h | C接种量 Inoculation amount/% |
|---|---|---|---|
| 1 | 27 | 8 | 1.5 |
| 2 | 29 | 16 | 2.0 |
| 3 | 31 | 24 | 2.5 |
1.2.5 复合乳杆菌发酵单因素实验 复合乳杆菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌,根据前期预实验确定二者的比例为1∶1,设置发酵温度33~41 ℃,发酵时间为8~48 h,接种量为1%~3%,测定复合乳杆菌活菌数及总酚含量,确定较适的发酵温度、发酵时间及接种量。
1.2.6 二步发酵工艺 参照1.2.4优化得到的酿酒酵母菌发酵工艺参数,先接种酿酒酵母菌发酵,发酵时间分别设定为8、16、24 h,然后再接种复合乳杆菌,按照1.2.2复合乳杆菌的最佳发酵工艺继续发酵24 h,至终点。测定酿酒酵母菌、乳杆菌活菌数,总酚含量、糖消耗量、酸生成量等的变化情况,确定复合乳杆菌的最佳接入时间。
（2）总糖和还原糖含量的测定：分别参照GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》和GB 5009.7-1985《食品中还原糖的测定方法》。
（3）乙醇含量的测定[8]：在经典重铬酸钾氧化比色法基础上,采用DNS氧化比色法测定葡萄糖含量, 修正乙醇含量的测定结果。
（4）乳酸菌、酿酒酵母菌活菌数的测定：参照GB/T 4789-2010中的相关方法。
（5）总酸的测定：参照GB/T 12456-2008。
（6）西番莲果皮酵素感官评价：对西番莲果皮酵素色泽、香气、口感进行评定,分为3个等级,A级2分,B级1分,C级0分,评价标准见表2,结果取平均值。
表2 西番莲果皮酵素感官评价标准Tab. 2 Sensory evaluation criteria of fermented passionfruit pericarp pulp |
| 感官评级 Sensory ratings | A（2分） | B（1分） | C（0分） |
|---|---|---|---|
| 色泽 | 色泽饱满,西番莲果皮特有红色 | 淡红色,颜色偏浅 | 色泽较暗,偏黄色 |
| 香气 | 有西番莲果香同时有轻微酒香 | 西番莲香气淡,酸味 | 无西番莲香气,酸味较重 |
| 口感 | 有西番莲果酸味无涩味,有轻微发酵酒味 | 酸味占比较大,西番莲香气弱 | 香气不愉快,酸味重 |
1.3 数据处理
样品做3次平行实验,采用Excel软件处理数据并作图。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母菌发酵
2.1.1 发酵温度对酿酒酵母菌活菌数和乙醇生成量的影响 乙醇作为发酵过程中主要的醇类物质和生成乙酸乙酯等酯类风味物质的中间产物,对风味生成起了很大贡献,因此乙醇生成量一定程度上代表了发酵过程中整个风味物质的产生情况,同时乙醇对杂菌的抑制可发挥重要作用。由图1可知,发酵时间设定16 h,酿酒酵母菌活菌数随温度上升呈先增长后下降趋势,在29 ℃时达到峰值7.28 lg CFU/mL,温度过高导致酿酒酵母菌繁殖代谢加剧,反而不利于活菌数的提高。乙醇生成量在温度上升过程中呈增加趋势,直到酿酒酵母菌数下降时,其增加趋势随之放缓。在温度较高时乙醇挥发较快,不利于香气保持,故选择温度水平为27~31 ℃。
2.1.2 发酵时间对酿酒酵母菌活菌数及乙醇生成量的影响 由图2可知,在发酵初始阶段,酿酒酵母菌数量增长迅速,乙醇生成量也随之上升,在16 h时活菌数达峰值8.47 lg CFU/mL,之后开始下降,达24 h后酿酒酵母菌数量趋于平缓,再继续延长发酵时间,体系内的酿酒酵母菌因为竞争营养成分、产生次生代谢物而进入负生长期;而乙醇生成量直到发酵后期才出现下降趋势,处于稳定期或衰退期的酿酒酵母菌,代谢活动中会产生大量次生代谢产物,如醛类、酸类等。在酿酒酵母菌分泌的酯类合成酶作用下,乙醇与这些次生代谢物质反应生成酯类等香气物质,在产香的同时也导致了乙醇含量的下降[1],因此综合分析酿酒酵母菌发酵时间以8~24 h为宜。
2.1.3 接种量对酿酒酵母菌活菌数及乙醇生成量的影响 由图3可知,随着接种量的增加,酿酒酵母菌活菌数和乙醇生成量会出现先增加后下降的趋势,在接种量为2%时,活菌数峰值为8.24 lg CFU/mL,乙醇生成量有最大值0.3%,之后逐步下降。接入的酿酒酵母菌活性较高,若初始菌数过多则会导致菌体在前期繁殖速度较快,过早、过量地消耗营养成分,后期由于竞争作用导致生长速度减慢,故使得活菌数开始降低,因此综合考虑取接种量范围为1.5%~2.5%。
2.1.4 酿酒酵母菌发酵正交优化实验结果分析 在单因素实验的基础上,采用正交实验进一步优化酿酒酵母菌发酵工艺参数,正交优化结果见表3。由极差分析得出,各因素对酿酒酵母菌活菌数和乙醇生成量的影响不同,其中对酿酒酵母菌数量的影响顺序为C>A=B,说明初始接种量对酿酒酵母菌的活菌数影响最大,发酵温度和发酵时间对酿酒酵母菌活菌数影响程度相同,优选水平组合为A1B3C2,即发酵温度为27 ℃,发酵时间24 h,酿酒酵母菌接种量2%;各因素对乙醇生成量的影响顺序为B>A>C,即发酵时间>发酵温度>接种量,发酵时间对乙醇生成量影响为最大,优选水平组合为A2B3C1或A2B3C3。
表3 酿酒酵母菌发酵正交实验优化结果L9(34)Tab. 3 Optimization results of S. cerevisiae fermentation orthogonal test L9(34) |
| 项目 Item | 实验号 Experimental number | A发酵温度 Fermentation temperature/℃ | B发酵时间 Fermentation time/h | C接种量/% Number of vaccinations | 活菌数 Number of active bacteria/(lg CFU/mL) | 乙醇含量 Ethanol content/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1（27） | 1（8） | 1（1.5） | 8 | 0.07 | |
| 2 | 1 | 2（16） | 2（2.0） | 8.16 | 0.1 | |
| 3 | 1 | 3（24） | 3（2.5） | 8.11 | 0.25 | |
| 4 | 2（29） | 1 | 2 | 8.08 | 0.13 | |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 7.95 | 0.18 | |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 8.1 | 0.3 | |
| 7 | 3（31） | 1 | 3 | 8.02 | 0.1 | |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 7.81 | 0.18 | |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 8.08 | 0.25 | |
| k1 | 8.09 | 8.03 | 7.97 | |||
| 活 | k2 | 8.04 | 7.98 | 8.11 | 优选组合A1B3C2 | |
| 菌 | k3 | 7.97 | 8.10 | 8.03 | ||
| 数 | R | 0.12 | 0.12 | 0.14 | ||
| 优水平 | A1 | B3 | C2 | |||
| 乙 | k1 | 0.14 | 0.10 | 0.18 | ||
| 醇 | k2 | 0.20 | 0.15 | 0.16 | 优选组合A2B3C1 A2B3C3 | |
| 含 | k3 | 0.18 | 0.27 | 0.18 | ||
| 量 | R | 0.06 | 0.17 | 0.02 | ||
| 优水平 | A2 | B3 | C1/C3 | |||
由表4方差分析结果进一步分析各因素影响的显著性可知,发酵温度对乙醇生成量的影响为极显著,而对活菌数影响为不显著,故发酵温度选择为A2;发酵时间对活菌数和乙醇生成量的影响均为极显著,选择水平为B3;接种量对乙醇含量影响为显著,对酿酒酵母菌数影响为不显著,结合考虑初始酵母接入量不宜太高,故选择水平为C1,故酿酒酵母菌发酵西番莲果皮工艺的最优参数水平为A2B3C1,即发酵温度29 ℃,发酵时间24 h,初始接种量1.5%。
表4 酿酒酵母菌发酵方差分析结果Tab. 4 Results of S. cerevisiae fermentation analysis of variance |
| 项目 Item | 来源 Source | 总变异 Total variation | 自由度 df | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value |
|---|---|---|---|---|---|---|
活 菌 数 | A | 0.014 007 4 | 2 | 0.007 003 7 | 12.855 201 | 0.301 |
| B | 0.115 251 9 | 2 | 0.057 625 9 | 105.771 58 | 0.026* | |
| C | 0.000 051 9 | 2 | 0.000 259 0 | 0.047 586 7 | 0.222 | |
| 误差 | 0.010 896 3 | 20 | 0.000 544 8 | |||
| 总和 | 1.033 1 | 27 | ||||
| 校正总和 | 0.140 207 4 | 26 | ||||
| 乙 醇 含 量 | A | 0.047 763 0 | 2 | 0.023 881 5 | 1.275 694 9 | 0.000** |
| B | 0.164 274 1 | 2 | 0.082 137 0 | 4.387 575 4 | 0.000** | |
| C | 0.060 763 0 | 2 | 0.030 381 5 | 1.622 910 3 | 0.000** | |
| 误差 | 0.374 407 4 | 20 | 0.018 720 4 | |||
| 总和 | 1 753.858 5 | 27 | ||||
| 校正总和 | 0.647 207 4 | 26 |
Note: *indicates significant difference (P<0.05), **indicates extremely significant difference (P<0.01). | |
注：*表示差异显著（P<0.05）;**表示差异极显著（P<0.01）。 |
2.2 复合乳杆菌发酵
2.2.1 发酵温度对复合乳杆菌活菌数和总酚含量的影响 由图4可知,复合乳杆菌活菌数在较大温度范围内都保持着较高的数量级,温度在35~41 ℃时其活菌数上升0.1%,基本没有出现显著变化;而在升温过程中,总酚含量呈上升趋势明显,在温度从35~41 ℃上升时,总酚含量上升19%。因为温度升高使乳杆菌分泌的酯酶活性提高,可以水解西番莲果皮浆中的酯类,产生酚类物质。而另一方面,温度上升乳杆菌产酸增加,酸性环境下的酚类不易被分解转化[9],因此较高温度有利于多酚物质的溶出且不被分解或转化为其他物质。较高温度对活菌保留和总酚的溶出及生成有利,但考虑高温条件下菌株之间的营养竞争加强,消耗营养物质速度加剧,且发酵果皮浆的风味成分散失加快,选择复合乳杆菌发酵温度为37 ℃。
2.2.2 发酵时间对复合乳杆菌活菌数和总酚含量的影响 由图5可知,发酵初始阶段基本没有出现延迟期,复合乳杆菌活菌数在发酵24 h左右到达最大值9.42 lg CFU/mL,当发酵时间超过24 h时,复合乳杆菌数量出现下降趋势,说明此时已接近复合乳杆菌生长繁殖的最活跃期。发酵液中的总酚含量在发酵前期出现上升趋势,至24 h时达到最大值28.19 μg/mL。分析原因,复合乳杆菌发酵产生的乳酸会降低体系pH,体系pH的下降保证了多酚物质不被分解转化,而在乳杆菌活菌数最高时酚含量出现了下降,可能原因是乳杆菌在代谢中产生的氨基酸、蛋白类与酚类反应,生成酯类化合物,导致酚类物质减少,但同时乳杆菌会产生一些乳酸脱羧酶,使结合酚分解为分子量较小的酚类[10,11],因此在发酵后期总酚含量会出现波动。综合分析发酵时间对复合乳杆菌活菌数和总酚含量的影响,选取最适发酵时间为24 h。
2.2.3 接种量对复合乳杆菌活菌数和总酚含量的影响 由图6可知,随着复合乳杆菌初始接种量增大,复合乳杆菌数量一直维持在较高数量级,接种量低于2%时,总酚生成量随接种量增加逐步升高,在接种量为2%有最大总酚含量25.61 μg/mL,继续提高接种量后总酚含量会出现下降趋势。发酵过程中总酚的生成与分解是一个动态过程,影响其含量的因素有很多,发酵过程中总酚含量的变化既与微生物的种类有关[12],酚的分解与合成也受到微生物分泌各种酶的调控,另外也与发酵过程的参数控制有很大关系[13,14,15],初始接种量较大时微生物代谢更加旺盛,但同时酚类物质的分解聚合也更加频繁,因此为保证较高的活菌数和总酚含量,取2%作为复合乳杆菌发酵的最适接种量。
2.2.4 乳杆菌发酵结果分析 综合分析乳杆菌发酵最优实验参数为发酵温度37 ℃,发酵时间24 h,接种量2%,但发酵结束后虽然果皮总酚较未发酵时有提升,但西番莲果皮浆的风味不佳,对后期制备西番莲果皮酵素粉不利,因此在此基础上,考虑引入酿酒酵母菌先行发酵,改善风味,达到既保留多酚同时也提升发酵西番莲果皮浆整体风味的目的。
2.3 二步发酵法发酵
乳酸菌单独发酵时虽然能较好的保存果皮总酚,但对西番莲果皮的风味保留不利;若进行混菌发酵,酵母与乳酸菌发酵的最适温度相差10 ℃,难以进行调控,同时无法完全发挥各自的优势,因此采用先接种酵母发酵,再接种乳酸菌发酵的分步发酵方法。由表5可看出,处理1即酿酒酵母菌发酵8 h、再接入复合乳杆菌发酵24 h至终点（发酵总时长为32 h）,复合乳杆菌的活菌数较高,发酵液中的总糖含量下降快,总酸含量从0.99 mg/mL上升到4.6 mg/mL,西番莲果皮发酵液中的总酚含量上升到24.2 μg/mL;处理2即酿酒酵母菌发酵16 h、复合乳杆菌发酵24 h至终点后（发酵总时长为40 h）,复合乳杆菌的活菌数等各项指标与处理1相比差异不大;处理3各项指标均低于处理1和处理2,产酸量随着乳杆菌接种时间延长,会出现下降趋势,分析原因,前期酿酒酵母菌在繁殖时会大量消耗糖类物质,导致接入的复合乳杆菌可利用的糖分减少,而酿酒酵母菌发酵产生乙醇等物质,乙醇积累到一定量不仅抑制杂菌的生长繁殖,也会抑制乳酸菌生长,酚类物质的积累和进一步生成依赖于酸性环境,乳酸下降不利于酚类物质的积累[16,17],因此活菌数、产酸量、总酚含量等都会出现下降,酿酒酵母菌发酵时间过长不利于复合乳杆菌的繁殖。与未进行发酵处理的西番莲果皮CK组相比,处理1、2在总酸、总酚含量上均有显著提升,处理3的总酚含量有所下降,虽然处理2的总酚含量略低于处理1,但酵母及乳酸菌活菌数均略高于处理1;酿酒酵母菌发酵时间过短不利于香气的保持,而发酵时间过长不利于总酚的积累,综合考虑,选择处理2,即酿酒酵母菌在29 ℃发酵16 h后再接种复合乳杆菌在37 ℃温度下继续发酵24 h。得到的最终发酵液中,酿酒酵母菌数量为7.78 lg CFU/mL,乳杆菌数量为8.93 lg CFU/mL,总酚含量24.01 μg/mL,酸含量4.42 mg/mL。
表5 酿酒酵母菌/复合乳杆菌发酵时间对发酵终点各指标的影响Tab. 5 Effect of S. cerevisiae / Lactobacillus fermentation time on various indexes of fermentation endpoint |
| 处理序号 Number | 酿酒酵母菌 发酵时间 Fermentation time of S. cerevisiae/h | 总发酵时间 Total fermentation time/h | 酵母活菌数 The number of S. cerevisiae /(lg CFU·mL-1) | 乳杆菌活菌数 The number of Lactobacillus /(lg CFU·mL-1) | 还原糖含量 Reducing sugar content /(mg·mL-1) | 总糖含量 Total sugar content /(mg·mL-1) | 总酚含量 Total phenol content /(μg·mL-1) | 酸含量 Acid content /(mg·mL-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 0 | 0 | 0 | 0 | 33.70 | 70.92 | 20.36 | 0.99 |
| 1 | 8 | 32 | 7.48 | 8.85 | 14.76 | 15.17 | 24.25 | 4.62 |
| 2 | 16 | 40 | 7.78 | 8.93 | 14.15 | 14.39 | 24.01 | 4.42 |
| 3 | 24 | 48 | 7.90 | 8.22 | 8.65 | 11.21 | 18.39 | 3.98 |
2.4 西番莲果皮浆感官评价结果
比较了单一乳酸菌发酵和酿酒酵母菌/乳酸菌复合发酵后的感官评价结果,复合菌种发酵后在香气和口感上得分均有提升,在口感上的提升尤为明显（表6）,即酿酒酵母菌在加入后不仅仅在风味上对酵素产生积极的影响,对酵素中乳酸菌活菌数也起到一定的维持作用。
表6 西番莲果皮酵素感官鉴评结果Tab. 6 Sensory evaluation of fermented passionfruit pericarp pulp |
| 评价对象 Target of evaluation | 色泽 Color | 香气 Aroma | 口感 Palate | 总得分 Total score |
|---|---|---|---|---|
| 乳酸菌单一发酵果皮浆 | 1.8±0.039 | 1.6±0.023 | 1.2±0.024 | 4.6±0.06a |
| 酿酒酵母菌/乳酸菌复合发酵果皮浆 | 1.8±0.012 | 1.7±0.027 | 1.8±0.011 | 5.3±0.04b |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). | |
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 |
3 讨论
通过二步发酵法获得了富含乳酸菌和酿酒酵母菌活菌、总酚含量高风味醇和的果皮发酵产品。优选的二步发酵工艺为：酿酒酵母菌接种量为1.5%,在29 ℃发酵16 h;再按照接种量2%,接种复合乳杆菌（干酪乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1）在37 ℃温度下继续发酵24 h至终点,获得的发酵液中,酿酒酵母菌数量为7.78 lg CFU/mL,乳杆菌数量为8.93 lg CFU/mL,总酚含量24.01 μg/mL,酸含量4.42 mg/mL。
对单一乳酸菌发酵西番莲果皮研究结果表明,乳酸菌在西番莲果皮浆中虽然有较好的适应性,且酚类物质的积累和生成较未发酵果皮有所提高,但整体风味差,且随发酵时间延长活菌数难以维持较高水平;若以酿酒酵母菌/乳酸菌进行混合发酵,由于二者发酵条件差异较大,发酵过程难以控制,且由于竞争作用导致混菌发酵不能同时充分发挥各自优势。本研究利用分步发酵法对西番莲果皮浆进行发酵,制备的西番莲果皮浆香气自然,且发酵液中总酚含量相比未发酵果皮有了一定提升,同时不同种类的益生菌活菌数也达到了较高水平,保证了产品的益生特性。分步发酵法能同时发挥酿酒酵母菌产香、产乙醇抑制杂菌,以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物质的优点。