香蕉是多年生草本植物,是重要的热地亚热带经济作物。其果实富含淀粉和黄酮类物质,是人们重要的粮食和营养来源[1]。在香蕉生长过程中,幼苗会经常受到各种非生物和生物胁迫的影响,如干旱、低温、盐[2,3]和枯萎病[4],严重地影响香蕉果实的产量和品质。尤其是香蕉枯萎病,由于抗病育种无法满足香蕉产业的需求,且没有有效的化学防治手段,造成香蕉栽培面积不断地减少[5]。在香蕉中,次级代谢物质与果实的品质形成、抗非生物胁迫和抗枯萎病的关系密切[6,7]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.5）催化保守的L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸,它是苯丙烷类代谢的第一个关键酶和限速酶[8]。PAL蛋白广泛存在于植物、真菌、酵母和藻类中。在植物基因组中,PAL编码1个小的多基因家族,分子量一般在220~330 ku,是一种酸性蛋白[9]。在植物中,多种次级代谢产物如花青素、木质素、激素、类黄酮和植物抗毒素等的合成都是源于苯丙烷类合成途径,PAL是该途径的第一个关键酶[10]。PAL基因的表达受各种环境胁迫的影响,如病原菌侵染、紫外线、伤害和光照等的诱导[11,12]。此外,PAL在植物防御系统中起着重要作用,参与信号分子水杨酸的生物合成,水杨酸是植物系统获得抗性所必需的有机酸[13,14]。截至目前,PAL基因在多种植物中被发现,例如葡萄（Vitis vinifera L.）[15]、大豆（Glycine max (Linn.) Merr.）[16]、陆地棉（Gossypium hirsutum Linn.）[17]、甜瓜（Cucumis melo L.）[18]、玉米（Zea mays L.）[19]、苹果（(Malus domestica)[20]、沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）[21]和核桃（Juglans regia L.）[22]等。在香蕉中,前期研究发现PAL参与香蕉果实抗冷[23],抗Mycosphaerella fijiensis侵染[24];在香蕉感染枯萎病菌后,PAL酶活性升高,且与香蕉的抗病性呈正相关[25]。截至目前,在香蕉中还未见PAL基因家族的全基因组分析的报道。
香蕉A基因组测序于2012年完成并公布测序结果[26],为在全基因组水平上对PAL基因家族进行分析鉴定、进化分析以及相关基因功能研究提供了数据支持。本研究通过生物信息学方法研究香蕉全基因组中的PAL基因家族的分类、系统进化关系、基因结构、基因表达等,以期明确PAL基因家族在香蕉果实发育和采后成熟,响应非生物和生物胁迫中可能发挥的作用,为深入研究香蕉苯丙氨酸解氨酶的功能奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以文献报道的拟南芥4个PAL的数据[27],在拟南芥数据库（http://www.arabidopsis.org/）中下载AtPAL的蛋白序列。以搜索到的拟南芥的AtPAL蛋白序列为查询序列（Query）,在香蕉A基因组数据库（http://banana-genome.cirad.fr/）中,通过Blastp 搜索出香蕉的可能的PAL蛋白序列和相关基因注释文件。
1.2 方法
1.2.1 香蕉PAL基因的氨基酸序列属性分析 利用ExPASy Proteomics Server（http://www. expasy.org/）的ProtParam tool软件在线分析蛋白的基本理化性质,包括蛋白的等电点、不稳定系数、分子量、脂肪指数和疏水性等。采用Plant-mPLoc Server （http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant- multi/#）在线预测分析MaPAL蛋白亚细胞定位情况。利用Gene Structure Display Server（GSDS）[28]软件分析内含子和外显子组成。
1.2.2 系统进化分析 利用MEGA 6.0软件对香蕉8个MaPAL成员与其他植物PAL基因的蛋白序列进行系统进化树的构建,方法采用邻接法（neighbor-joining,NJ）,采取以下参数设置：校验参数Bootstrap重复1000次,模式为p-diastance model,缺口设置为partial deletion[31]。
1.2.3 MaPAL基因在巴西蕉果实成熟过程、响应逆境处理中的表达特征分析 从本实验室前期获得的巴西蕉转录组数据可获得包括巴西蕉果实的发育过程,以及谢花后0 d（0DAF）、谢花后20 d（20DAF）、谢花后80 d（80DAF-0DPH）,果实采后成熟0 d（80DAF-0DPH）、8 d（8DPH）和16 d（16DPH）;巴西蕉叶片在干旱（osmotic,200 mmol/L mannitol）处理7 d、低温（cold,4 ℃）处理22 h和盐（salt,300 mmol/L NaCl）处理7 d等非生物胁迫后的叶片和巴西蕉根系接种Foc TR4后0 d（0DPI）和2 d（2DPI）的根系等转录组数据,上述数据均上传至国家基因库（https://db.cngb.org/cnsa/）的CNGBdb数据库（登录号：CNP0000292）。从上述转录组数据中抽取PAL基因的表达数据。转录本丰度用RPKM（reads perkilo bases per million reads）值表示。提取PAL基因在果实中的数据以RPKM值表示;胁迫条件下的RPKM值通过取对数（log2）转换,利用MeV v 4.3软件作热图。
2 结果与分析
2.1 香蕉PAL基因家族全基因组鉴定及基本理化性质分析
以拟南芥PAL基因的蛋白序列为Query序列,通过Blastp软件在香蕉基因组数据库进行比对,利用NCBI Blastp比对和SMART验证获得8个香蕉PAL家族成员（表1）。8个PAL基因定位在Chr1、Chr2、Chr5、Chr8、Chr9和Chr 11号染色体上,其中Chr 5和Chr 11染色体有2个成员,其余染色体均为1个;按照上述成员在香蕉染色体的顺序和位置命名为MaPAL1~MaPAL8。MaPAL家族基因的蛋白质的长度分布于700~782 aa;分子量分布在75.96~85.95 ku;等电点范围在5.76~6.23之间。不稳定指数分析发现8个MaPAL蛋白不稳定指数都小于40,为稳定蛋白[32]。利用Plant-mPLoc对MaPAL基因家族的蛋白质成员进行亚细胞定位预测分析,蛋白都定位于细胞质内。
表1 香蕉PAL基因家族成员基本信息Tab. 1 Basic information of MaPAL gene family |
| 基因名称 Gene name | 基因ID Gene ID | 染色体编号Chromosome number | 定位 Location | 氨基酸数目 Numbers of amino acids /aa | 分子量Molecular weight/ku | 等电点Isoelectric point | 不稳定指数 Instability index | 不稳定指数Instability index | 亚细胞定位Subcellular localization | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MaPAL1 | Ma01_g04420 | chr01 | 2938936 | 2941177 | 712 | 77.11 | 5.87 | 33.55 | 33.55 | Cytoplasm |
| MaPAL2 | Ma02_g00760 | chr02 | 6331747 | 6334592 | 711 | 76.83 | 5.76 | 36.14 | 36.14 | Cytoplasm |
| MaPAL3 | Ma05_g03720 | chr05 | 2748035 | 2750718 | 709 | 76.89 | 6.23 | 35.53 | 35.53 | Cytoplasm |
| MaPAL4 | Ma05_g20900 | chr05 | 32610528 | 32613521 | 711 | 76.94 | 6.00 | 33.60 | 33.60 | Cytoplasm |
| MaPAL5 | Ma08_g14940 | chr08 | 14871358 | 14873806 | 709 | 76.92 | 5.86 | 33.28 | 33.28 | Cytoplasm |
| MaPAL6 | Ma09_g15390 | chr09 | 10719758 | 10722106 | 782 | 85.95 | 5.95 | 38.55 | 38.55 | Cytoplasm |
2.2 香蕉PAL家族基因结构、系统进化及PAL蛋白的结构分析
通过使用GSDS在线软件分析MaPAL家族基因的外显子/内含子构成发现,MaPAL1、MaPAL2、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5、MaPAL7和MaPAL8基因的外显子数目为2个,MaPAL6只有1个外显子（图1）。使用邻接法（neighbor- joining,NJ）构建系统发育树来研究MaPAL之间的进化关系。MaPAL家族可以明显分为2大类（图2）,其中MaPAL1、MaPAL2、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5、MaPAL7和MaPAL8与拟南芥的相关成员聚集在一起,说明PAL与植物的单双子叶分化前就已经形成,MaPAL2与MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5的蛋白序列相似性分别为98%、98%和99%,些成员间的相似性较大。而另一亚支是MaPAL6,该成员与拟南芥和水稻没有同源基因,与橡胶树等木本植物的PAL基因有较高的亲缘关系。多序列比对分析发现,所有MaPAL基因的氨基酸序列中都含有PAL的活性位点GTITASGDLV(L)PLSYIAG,在该位点中包含Ala-Ser-Gly组成的高度保守的亚甲基咪唑酮（MIO）亲电基团（图3）。上述结果说明在进化上PAL比较保守,而MAPAL6与其他成员可能具有不同起源。
图2 香蕉、拟南芥、水稻PAL的系统进化树Fig. 2 Neighbor joining phylogenetic tree of PAL in banana, Arabidopsis thaliana and rice |
2.3 MaPAL在果实发育和采后成熟中的表达分析
对巴西蕉果实发育和采后成熟过程的5个关键点0DAF（抽蕾0 d）、20DAF（断蕾20 d）、80DAF-0DPH（断蕾80 d-采后成熟0 d）,8DPH（采后成熟8 d）、14DPH（采后成熟14 d）进行了转录组分析（图4）。MaPAL1、MaPAL2、MaPAL3、MaPAL6、MaPAL7和MaPAL8在果实发育阶段（0DAF、20DAF）表达量较高;但这些成员在果实采后成熟阶段几乎不表达。MaPAL4基因在果实发育和采后成熟2个阶段一直是高水平表达（RPKM>10）,而且该成员在采后的表达达到显著差异表达（Log2 RPKM>1）,表明该成员可能在香蕉果实发育和采后成熟中起着重要作用。MaPAL5在果实发育和采后成熟过程都不表达,表明该成员可能不参与香蕉果实发育和采后成熟过程。
2.4 MaPAL在香蕉响应胁迫处理的表达分析
如图5所示,在低温处理条件下,MaPAL1、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5、MaPAL7和MaPAL8显著上调表达;MaPAL2和MaPAL6显著下调表达。在干旱条件下,MaPAL3、MaPAL4、MaPAL1、MaPAL5和MaPAL7显著上调表达,MaPAL2、MaPAL6和MaPAL8显著下调。在盐胁迫下,MaPAL2、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL1、MaPAL5、MaPAL7和MaPAL8显著上调表达,MaPAL6显著下调表达。在3种非生物胁迫条件下,我们发现MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5、MaPAL1、MaPAL7和MaPAL6均显著上调和下调,参与香蕉响应上述3种非生物胁迫。在枯萎病处理中,所有8个MaPAL基因全部下调表达,其中MaPAL5下调最明显。表明巴西蕉在遭受Foc TR4侵染后,全面抑制了MaPAL基因的表达。上述结果也表明PAL基因家族成员参与香蕉响应逆境的过程。
3 讨论
PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶,是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶,苯丙烷类代谢途径的产物在植物生长发育和响应逆境过程中发挥着重要作用[33]。本研究对香蕉基因组中的PAL基因进行鉴定,并且进一步探讨了MaPAL蛋白的理化性质、基因结构、系统进化关系及其在果实发育、采后成熟、响应非生物和生物胁迫中的表达模式。本文在香蕉A基因组中共鉴定出8个MaPAL基因,与水稻（9个）[34]、杨树（5个）[35]和拟南芥（4个）[36]基因组中的PAL数量相差不大,表明PAL在植物中确实以小基因家族的形式存在[37,38]。在氨基酸长度、分子量及等电点方面8个MaPAL都与其他植物的PAL蛋白类似[39,40,41]。理化性质分析结果显示,8个MaPAL都是酸性蛋白质,与之前报道的PAL是一种酸性蛋白的结果一致[42]。序列比对发现,MaPAL结构高度保守,都含有1个由Ala-Ser-Gly组成的高度保守的亚甲基咪唑酮（MIO）亲电基团[43],这是PAL基因家族的特征序列。本研究预测所有的PAL均位于细胞质类,与前人的报道一致[37, 44],说明香蕉PAL基因在细胞质内发挥作用。在进化方面,MaPAL基因能分为两类,其中MaPAL1、MaPAL2、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL5、MaPAL7和MaPAL8分为一个亚支,这些成员间具有较高的同源性;而MaPAL6单独与其他木本植物的PAL分为一亚支。这与其他物种结果类似[45]。上述特征表明MaPAL1~8确实属于香蕉PAL基因家族的成员。
PAL基因参与植物响应病原菌过程[8, 24, 52-53],PAL酶活往往作为植物抗病的标志酶[25]。在拟南芥中,pal1/pal2/pal3/pal4的4敲除突变体表现发育不良和不育的表型,同时易感丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）[27]。巴西蕉作为香蕉的主要栽培品种,易感枯萎病[4,5]。本研究中,接种枯萎病的巴西蕉根系中MaPAL基因的表达显著被抑制（图5）,说明MaPAL基因参与香蕉响应枯萎病菌侵染的过程。酚酸类物质参与香蕉抗枯萎病的过程[7],在感病品种中抑制MaPAL基因的表达可以减少次级代谢物质的合成,影响抗病物质的合成。上述结果说明MaPAL基因可能在香蕉抗枯萎病中起着重要作用。
4 结论
基于香蕉A基因组的序列信息,获得8个MaPAL家族成员信息, 并完成系统进化分析。MaPAL家族基因在果实发育时期表达量较大, 而在果实成熟中只有MaPAL4差异表达;在响应非生物胁迫时,大部分MaPAL成员都参与香蕉响应低温、干旱和盐胁迫的过程;8个MaPAL基因在感病香蕉品种接种Foc TR4后表达均被抑制。说明MaPAL基因在香蕉响应逆境中起着重要作用。本研究结果为今后在香蕉中开展MaPAL调控次级代谢物质合成的遗传调控研究奠定了基础。