番木瓜（Carica papaya L.）属番木瓜科番木瓜属植物,为热带、南亚热带常绿软木质大型多年速生草本果树,常规生产种植使用种子培育的实生苗,由于其种性复杂,一般分为雌株（占20%~30%）、两性株（占60%~70%）和雄株（占3%~5%）。两性株所结果实由于其果肉厚、果形美观均一等特点具有商品价值。因此,利用种子培育实生苗应用于实际生产中时,等株性明确后必须采取“除雄去雌补种两性”的工序,这会造成财力、人力的浪费,大大增加了生产成本。成龄侧芽组织培养技术可解决这一番木瓜生产上的问题,但由于该技术存在外植体灭菌难、催根难和移栽成活率低等问题,使得这一技术未能取代种子实生苗而规模化应用于生产中[1,2,3]。
实生苗茎尖组织培养技术由于番木瓜苗期性别鉴定技术的研究而得到了开发。何尧声等[4]利用分子标记技术筛选获得了番木瓜性别特异SCAR标记的基因片段：番木瓜雄株特异基因片段（1001 bp）、两性和雄性的特异基因片段（225 bp）设计引物,对番木瓜苗期株性进行了多重PCR鉴定,其准确率几乎达到100%,用这一技术鉴定番木瓜实生苗株性是完全可行的。但单株批量性别鉴定两性实生苗,用于实际生产中明显存在成本提高的问题,而基于番木瓜实生苗性别鉴定技术的组织培养种苗繁育体系的研究至今未见报道。
番木瓜品种‘蔬罗’是主栽品种,生产上对优质种苗的需求量较大;‘蜜红’品种是三亚缘之海公司用‘小白’和美国‘line’品种杂交选育的品种,由于含糖量高（>15%）、有蜂蜜奶香味,近年来颇受消费者的青睐,果品的需求量大,种苗的需求量也大。因此,本研究利用多重PCR技术鉴定筛选这2种番木瓜的两性株进行组织培养种苗繁育,建立和优化番木瓜实生苗两性株组培苗繁殖体系,不仅能解决成龄侧芽来源的无根苗催根难和移栽成活率低的问题,而且有利于番木瓜实生苗组培种苗的规模化生产和应用,这对促进番木瓜生产和相关产业的发展具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
每年9—11月份选择晴天午后3：00—5：00,从中国热带农业科学院热带生物技术研究所番木瓜课题组实验田栽培的‘蔬罗’‘蜜红’母株上采集外表呈“三画黄”的番木瓜果实,用无菌水清洗番木瓜3次,转移到超净台后,用70%酒精仔细擦洗果实表面;若果实较小,也可将整个番木瓜放入6%次氯酸钠溶液里浸泡,尽量使其淹没,过程中加以摇晃,8 min后取出,用无菌水泡洗4~5次;把消毒纸垫在番木瓜下面后,用消过毒的刀子慢慢切开番木瓜,取出种子放到无菌滤纸上晾晒,然后用镊子把种子表面的膜去除,直接播种到MS或继代培养基中,每瓶培养基宜播种5~8粒种子,27~28 ℃,1500 lx光照12 h培养2~3周形成小苗备用。
预备实验中选择‘蔬罗’（A）、‘日升’（B）、‘穗中红’（C）、‘台农2号’（D）、‘蜜红’（F）等5个品种（系）大田两性株、雄株和雌株的嫩叶提取DNA进行多重PCR验证。本预备实验中成龄植株两性株的DNA提取方法参照文献[4]。
营养生根剂：双吉尔-GGR（含氨基酸水溶肥料）为北京艾比蒂生物科技有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 实生苗性别鉴定 （1）实生苗叶片DNA提取 培养20 d后种子萌发出幼苗,选取10株番木瓜幼苗分别在培养瓶底编号为1~10。在超净台用消过毒的剪刀剪下1~2片嫩叶（约100~200 mg）,装入相应编号的离心管里。采用TIANGEN公司生产的植物基因试剂盒提取总DNA,具体操作方法见产品说明书。
（3）多重PCR扩增和电泳分析 预备实验：选择‘蔬罗’（A）、‘日升’（B）、‘穗中红’（C）、‘台农2号’（D）、‘蜜红’（F）等5个品种（系）两性株、雄株和雌株进行多重PCR验证实验。采用25 µL反应体系：Taq酶Mix缓冲液12.5 µL,4种引物各0.5 µL,基因组DNA 1 µL,补足ddH2O至25 µL。扩增反应：94 ℃,3 min后,进行94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,1 min;30个环循。1.5%琼脂糖凝胶电泳：在120 V电压下电泳20 min。电泳结束后,将凝胶放入凝胶成像仪里观察分析多重PCR扩增结果。
检测实验：采用上述同样方法对‘蔬罗’‘蜜红’无菌实生苗进行多重PCR扩增,按事先编号对所属材料进行扩增及电泳分析,记录属于两性株的番木瓜实生苗编号,取其茎尖作为下一步组织培养繁育的材料。
1.2.2 实生苗两性株无根苗诱导及繁殖 取经性别鉴定为‘蔬罗’‘蜜红’两性株的幼苗茎尖,接种于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L（pH=5.8）上,在28 ℃、2000 lx条件培养约30 d形成丛芽,分割成小丛芽接种于MS+BA 0.5 mg/L+KT 0.25 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂 6g/L（pH=5.8）上,在28 ℃、2000 lx条件培养30 d进行继代及壮苗培养。
1.2.3 实生苗两性株生根诱导及移栽试验 对检验获得的‘蔬罗’番木瓜两性实生苗茎尖进行继代培养,待扩繁获得继代苗并壮苗后,将无根苗分单株接种于1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂6 g/L（pH=5.8）上,每次试验接种30株,重复3次。其次利用对比试验将蔬罗无根苗浸泡在浓度梯度分别为10、25、50、75 mg/L的营养生根水中6 h,确定成苗率最高的生根水浓度,再以此浓度做不同梯度浸泡时间试验,分别为2、4、6、8 h,最终确定成苗率最高的生根水浸泡时间。
挑选生根培养基里长势良好的‘蔬罗’木瓜苗,根据1.2.3获得的生根水最佳催根浓度与最佳浸泡时间浸泡木瓜苗,分3次移栽,每次分别移栽了38、36、39株,做好试验记录,统计实生苗两性株的移栽存活率。
以上催根试验同时以‘蜜红’品种作对比验证。
1.2.4 实生组培苗田间株性鉴定 经多重PCR筛选出的实生两性株经过组培苗培育移栽田间4个月,待其开花结果时从花型上观察性别,以此来验证PCR技术鉴定的番木瓜实生苗性别的准确性。
1.3 数据处理
利用Excel软件和SAS软件对试验得到的相应数据进行方差显著性分析。
2 结果与分析
2.1 利用多重PCR鉴定实生苗性别结果
多重PCR预备实验扩增结果如图1。以雄株总DNA为模板得到1条1001 bp和1条225 bp的扩增产物带,以雌株总DNA为模板无扩增产物,以两性株总DNA为模板得到1条225 bp的扩增产物带。将多重PCR扩增获得的1001 bp和225 bp的扩增产物回收、克隆并送到大连Takara公司进行测序,应用Vector NTI 9.0分析软件对测序后的序列进行分析,测序后的序列与番木瓜性别特异基因序列的同源性达到99%以上。可见根据多重PCR扩增结果,能够准确地将番木瓜两性株鉴定出来,可用于番木瓜种子实生苗两性株的筛选。
利用上述方法对10株‘蔬罗’番木瓜实生苗进行多重PCR性别鉴定,扩增结果（图2）显示：1、3、5、7号DNA样品能扩增出225 bp条带,说明所对应编号的4株番木瓜实生苗则为两性株。2、4、6、8、9、10未扩增出DNA条带,则为雌株。本实验所选10株实生苗未测出雄株,‘蜜红’多重PCR性别鉴定结果与‘蔬罗’基本相符。结合后期田间的实际植株生长发育的观察情况,这种性别鉴定技术的准确率达98%以上,可用于实生苗幼龄期的两性株鉴定。
2.2 采用实生苗两性株繁殖无根苗结果
2.3 诱导实生两性组培苗生根及其移栽结果
2.3.1 最佳生长调节剂的生根诱导结果 试验结果显示,以成龄侧芽组培筛选出的最佳生长调节剂组合IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L配制的生根培养基对实生两性组培苗的生根诱导效果更加明显,每次试验的催根率都要高于成龄侧芽组培苗,其3次试验的平均催根率达到81.1%,比成龄侧芽组培苗66.7%高出约14.4%（表1）,方差显著性分析结果为差异显著（P<0.05）。而且番木瓜实生苗来源的组培苗无论是生长周期还是长势都比成龄侧芽来源的组培苗好,多数木瓜苗在继代2~3代后就能长到10 cm,且十分健壮,这在成龄侧芽组培苗培养过程中比较少见。从不同番木瓜品种的‘蜜红’和‘蔬罗’实生苗来源的组培苗在催根率上可以看到,‘蔬罗’的催根率比‘蜜红’的催根率高21.1%（表2）,表明不同的番木瓜品种在同一培养基质上产生差异明显的结果,这进一步证明在番木瓜组培苗培育过程中存在着品种或基因依赖性问题,因此研究通用型的番木瓜组培苗培育规程,包括培养基质,对实际生产中大规模推广应用番木瓜组培苗替代种子实生苗具有极其重要的现实意义[2, 8]。本研究利用幼态型外植体解决成龄侧芽来源的番木瓜组培苗催根率和移栽成活率低的问题,至于通用型培养规程还有待于更深入的研究。
表1 最佳生长调节剂浓度下不同组培苗的催根率Tab. 1 Rooting rate of different types of tissue culture seedlings under under optimized growth regulator concentration |
| 组培苗类型 Type of tissue seedling | 催根率 Root rate /% | 平均催根率 Average root rate/% | 生长状况 Growth condition | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | |||
| 成龄侧芽组培苗 | 73.3 | 60.0 | 66.7 | 66.7 | 部分苗根系发达,生根快,愈伤组织比较多,叶片较小 |
| 种子两性苗 | 83.3 | 76.6 | 83.3 | 81.1 | 普遍根系发达,生根很快,愈伤组织比较少,叶片大且多. |
Note: The growth regulator is IBA: 0.75 mg/L, NAA: 0.05 mg/L, KT: 0.01 mg/L. | |
注：培养基添加生长调节剂为IBA：0.75 mg/L,NAA：0.05 mg/L,KT：0.01 mg/L。 |
表2 不同品种两性组培苗在最佳生长调节剂浓度下的催根率Tab. 2 Rooting rate in different species of hermaphroditic tissue culture seedlings under optimized growth regulator concentration |
| 组培苗品种 The variety of tissue culture seedling | 平均催根率 Average root rate/% | 生长状况 Growth condition |
|---|---|---|
| 蔬罗 | 81.1 | 生根苗生长周期短,茎干健壮,生根很快 |
| 蜜红 | 60.0 | 生根苗生长周期短,茎干健壮,生根较快 |
Note: The growth regulator is IBA: 0.75 mg/L, NAA: 0.05 mg/L, KT: 0.01 mg/L. | |
注：培养基添加生长调节剂为IBA：0.75 mg/L,NAA：0.05 mg/L,KT：0.01 mg/L。 |
2.3.2 生根剂最佳浓度和浸泡时间作用下的移栽成活结果 利用诱导生根后的番木瓜实生两性组培苗做移栽试验。在成龄侧芽组培苗试验中筛选出的最佳浓度50 mg/L的生根剂里浸泡8 h的基础上,在相同的实验条件下,统计3次试验的成活率分别为92.1%、91.7%、89.7%,其平均成活率达到91.1%,比成龄侧芽组培苗87.5%的成活率稍显高,且番木瓜苗生长速度很快,对环境的适应性则更强[9,10]。方差显著性分析结果为差异显著（P<0.05）。以上试验结果说明,采用同样的试验条件和方法,实生两性组培苗对于生长调节剂和生根剂最佳浓度以及浸泡时间的应激性效果更好（表3）。可能原因是不同组织器官对于基因表达和应激能力不一样[11,12]。
表3 最佳生根剂浓度和浸泡时间下不同组培苗的移栽成活率Tab. 3 Transplanting survival rate in different types of tissue culture seedlings under best rooting agent concentration and soaking time |
| 组培苗类型 Type of tissue seedling | 移栽成活率 Transplanting survival rate /% | 平均移栽成活率 Average survival rate of transplanting/% | 生长状况 Growth condition | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | |||
| 成龄侧芽苗 | 87.5 | 93.8 | 81.2 | 87.5 | 生根苗生长周期长,茎干细长,生根快 |
| 种子两性苗 | 92.1 | 91.7 | 89.7 | 91.1 | 生根苗生长周期短,茎干健壮,生根很快 |
Note: The concentration of rooting agent is 50 mg/L, and the soaking time is 8 h. | |
注：营养生根水使用浓度为50 mg/L,浸泡8 h。 |
同时在实验过程中也发现,不同番木瓜品种（‘蔬罗’‘蜜红’）两性组培苗的最佳生根剂浓度和浸泡时间下的移栽成活率也不尽相同（表4）,但差异不大,方差显著性分析结果为不显著（P>0.05）。从总体效果上看实生苗两性株组培苗比成龄侧芽组培苗优势明显,能满足商业生产的水平。
表4 不同品种两性组培苗在最佳生根剂浓度和浸泡时间下的移栽成活率Tab. 4 Transplanting survival rate in different species of hermaphroditic tissue culture seedlings under best rooting agent concentration and soaking time |
| 组培苗品种 The variety of tissue culture seedling | 平均移栽成活率Average survival rate of transplanting/% | 生长状况 Growth condition |
|---|---|---|
| 蔬罗 | 91.1 | 生根苗生长周期短,茎干健壮,移栽后生根很快 |
| 蜜红 | 86.7 | 生根苗生长周期短,茎干健壮,移栽后生根较快 |
Note: The concentration of rooting agent is 50 mg/L, and the soaking time is 8 h. | |
注：营养生根水使用浓度为50 mg/L,浸泡8 h。 |
2.4 从成龄株植性状上验证多重PCR性别鉴定的结果
3 讨论
3.1 避免在鉴定番木瓜实生苗两性株性别时产生“假阳性”结果
在本研究的试验过程中,对实生苗采用了PCR技术做性别鉴定时发现,利用何尧生等[4]报道的多重PCR技术方法对番木瓜实生苗进行性别鉴定,结果出现极少量的性别“假阳性”——即雌株或两性株被鉴定为雄性或既是雄株又是两性株的情况,给鉴定的准确率带来一定的不确定性。本研究用同样的方法提取番木瓜总DNA,并以此作为模板采用单一PCR技术,同时调整PCR循环参数,鉴定结果发现准确率相当高,经分析推测产生这样的结果可能是多重PCR在扩增过程中不同引物间相互作用或反应体系的复杂性造成的“假阳性”。因此,笔者采用单一PCR技术尽管在实验步骤上会繁琐一点,即把每个DNA模板按两份分开加不同的引物,这能保证稳定准确的鉴定结果,对进一步开展实生苗组培种苗技术研发具有重要意义。
3.2 需要对实生苗组织培养体系作进一步的优化和深入研究
由于番木瓜株性复杂,种子组培苗在初始培养的苗期无法保证株性一致,需要对株苗做性别鉴定,待筛选到具有商业化价值的两性株时作为外植体进行组培研究,虽然这一技术较易获得无菌材料,并且材料为幼态更易进行后续的增殖及诱导生根,但以此培育的组培种苗在性状（如果型、品质、产量及抗病性等）上难以预测,这在一定程度上需要其他分子及生化证据的支持,因此除了对性别进行鉴定外,还应对各实生苗的遗传性状进行确定,包括果实的品质、抗病、耐寒、矮化、高产等,而这些性状仅在植株生长到成熟阶段才能确定,这需要在今后的工作中研究获得相关的分子证据及佐证技术方法证实苗期的性状。成龄侧芽在组培过程中除了预备期外植体消毒难,以及老态化而导致低诱根率和低移栽成活率问题外,其培育的组培苗不仅与母体一样的两性株,而且具有明确的与母体一样的优良性状。这是采用成龄侧芽进行组培种苗研发的最大优势,也是目前利用种子实生苗进行组培苗快繁无法比拟的[6]。因此番木瓜组培种苗生产上还是优先采用两性成龄侧芽开展的生产,而实生两性组培苗则有待于开展幼苗期与品质、产量等相关的分子生物学基础研究。笔者认为两者可以结合一起运用于生产中,即利用实生两性组培苗技术建立多个株系,通过田间比较筛选优良母株作为后期两性成龄侧芽组培苗培养的材料,这样就有可能保证组培种苗在生长速度、遗传稳定、植株质量等方面都能取得俱佳的效果。针对番木瓜组培苗的快速繁殖,应加强对实生两性组培苗的基础及技术研究,大力推广组培苗的规模化生产,并通过政府、研究机构等渠道加强宣传番木瓜组培种苗的优势,让更多生产商参与进来,加快推进番木瓜产业更快的发展,同时也坚信未来番木瓜常规的种子繁殖也会逐渐被组织培养所取代[13,14]。