甘薯（Ipomoea batatas Lam.）又名红薯、地瓜等,在世界范围内均有广泛栽培,是全球第七大农作物[1]。甘薯高产、耐瘠薄且营养丰富,不仅是重要的粮食作物[2],还是重要的工业原料、饲料、新型能源及保健作物[3]。中国是世界上主要的甘薯生产国,2014年中国甘薯的栽培面积和产量分别占全球的42%和68%（FAO,2015）,稳居世界第一。随着人们生活水平的不断提高,我国甘薯消费结构正在向饲料比例减少、鲜食和食品加工比例增加的方向发展,人们对甘薯品质的要求越来越高[4]。其中,淀粉和可溶性糖含量是影响鲜食型甘薯品质的重要因素。
虽然多年来我国在甘薯育种领域取得长足进步,先后选育出多个不同用途的优良甘薯品种,但在甘薯品质方面和发达国家相比仍存在一定的差距。例如,与美国、日本等国相比,我国加工专用品种的淀粉含量相对较低,有很大的提升空间[5]。此外,甘薯块根中的可溶性糖含量受环境和栽培条件的影响,波动较大[6,7,8],如何选育出糖含量高且相对稳定的优良鲜食和食品加工专用甘薯品种需要进行深入研究。
蔗糖分解代谢在植物生长发育中发挥着重要的作用,不仅可以为植物生长发育和干物质积累提供碳骨架和能量,而且分解产生的己糖可以作为信号分子通过调控基因的表达来影响植物的生长发育进程[9]。植物体内有两种分解蔗糖的酶类：蔗糖转化酶（INV）和蔗糖合成酶（Sus）。Sus将蔗糖分解为UDP-葡萄糖和果糖,该反应为可逆反应[10]。蔗糖转化酶（INV）则是将蔗糖分解为葡萄糖和果糖,该反应为不可逆反应。根据亚细胞定位的不同,转化酶可进一步分为细胞壁蔗糖转化酶（CWIN）、液泡蔗糖转化酶（VIN）和细胞质蔗糖转化酶（CIN）[10]。大量的研究表明,不同的蔗糖分解酶在植物生长发育中发挥不同的作用。例如,Sus分解产生的己糖主要参与淀粉和纤维素的合成,CWIN主要调控蔗糖在植物体内的运输和分配,VIN调控液泡中糖分的积累和细胞膨大,而CIN分解产生的己糖则用于呼吸作用,同时影响植物的抗氧化能力[9]。
研究表明,蔗糖分解代谢在植物贮藏器官的可溶性糖和淀粉含量中起着决定性作用[9]。例如,利用反义RNA技术下调马铃薯中Sus的表达会导致块茎中淀粉含量的下降[11,12],而通过转基因手段下调胡萝卜中VIN的表达会降低肉质根中己糖含量[13]。在马铃薯中,下调VIN的活性会抑制低温储藏过程中发生的块茎‘变甜’现象,有效阻止后续食品加工过程中因为还原性己糖（如葡萄糖）含量过高而导致的‘褐变’现象[14,15]。
上述研究表明,蔗糖分解酶在马铃薯和胡萝卜等块根/块茎作物的品质形成中发挥着重要的作用。然而,到目前为止,国内外的研究大多集中在对甘薯块根中淀粉和糖分含量的研究上,尚不清楚蔗糖分解酶在甘薯块根可溶性糖和淀粉含量调控中的具体作用。本项目以2个在可溶性糖和淀粉含量上存在显著差异的甘薯品种为材料,对块根中的4种蔗糖分解酶活性、可溶性糖和淀粉含量进行系统研究,以期初步鉴定出调控甘薯块根中可溶性糖和淀粉含量的关键蔗糖分解酶类,为下一步通过常规育种手段或分子育种技术选育优异甘薯新品种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
甘薯扦插苗取自海南大学热带农林学院甘薯种质资源苗圃。本研究在海南大学热带农林学院农科基地大棚内进行,试验时间为2017年11月17日至2018年3月17日。栽培基质为蛭石、泥炭和田园土,混合比例为1∶1∶2。基质容器选用塑料花盆,规格25 cm（直径）×19 cm（高）,每盆种植1株甘薯,常规水肥管理,吊蔓栽培。本研究共2个甘薯品种,每个品种4次重复,每个重复为1个植株（盆）。甘薯茎尖扦插后120 d时进行取样,将甘薯块根挖出后洗净擦干并取样。取样时每个重复从2个薯块的中间位置准确切取0.3 g样品,于液氮中速冻后存放在-70 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2 方法
甘薯块根内蔗糖、葡萄糖和果糖含量的测定参照Lunn等[19]的酶学方法,以鲜重计。
淀粉含量的测定参照Smith等[20]的酶学方法进行,以鲜重计。
转化酶和蔗糖合成酶活性的测定采用分光光度计方法,具体参照Tomlinson等[21]的方法,2个酶活性单位均以每小时每克甘薯内转化成葡萄糖的微摩尔数表示,μmol/(h·g)。
1.3 数据处理
利用Excel 2003软件进行t-test分析。用SPSS 22.0软件进行相关性分析,采用LSD法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同品种块根中淀粉和可溶性糖含量的差异
对2个甘薯品种块根中淀粉含量的测定表明,‘商薯19’块根中的淀粉含量显著高于‘苏薯17’（图1）。对块根中可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量的测定表明,甘薯块根中的可溶性糖主要为蔗糖,而葡萄糖和果糖的含量相对较低,且葡萄糖和果糖含量之间差异不大（图2A）。同时,不同品种在糖分相对组成上存在较大差异,‘商薯19’块根中的葡萄糖和果糖含量均显著高于‘苏薯17’,但2个品种在蔗糖含量上差异不显著（图2A）。虽然‘商薯19’块根中的己糖（葡萄糖和果糖之和）含量显著高于‘苏薯17’,但总可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖之和）含量在2个品种间并不存在显著差异（图2B）。因此在2个品种中,‘苏薯17’属于低淀粉低己糖品种,而‘商薯19’属于高淀粉高己糖品种。
图1 2个甘薯品种块根中的淀粉含量*表示两品种之间存在显著差异（P<0.05）。 Fig. 1 Starch content in the storage root of two sweet potato cultivars * indicates significant difference between transgenic and wild-type sweet potato (P<0.05). |
2.2 不同品种块根中蔗糖转化酶和蔗糖合成酶活性的差异
图3 2个品种甘薯块根中的转化酶和蔗糖合成酶活性*表示品种间存在显著差异（P<0.05）,**表示品种间存在极显著差异（P<0.01）。 Fig. 3 Activities of invertase and sucrose synthase in the storage root of sweet potato cultivars * indicates significant difference between transgenic and wild-type potato (P<0.05), ** indicate extremely significant difference between transgenic and wild-type potato (P<0.01). |
2.3 块根中蔗糖分解酶活性与己糖和淀粉含量之间的相关性分析
上述糖含量和酶活性的测定表明,块根中高活性的Sus对应着高含量的淀粉,而高活性的CIN和VIN对应着高含量的己糖。为了进一步验证该结论是否正确,我们对来自2个甘薯品种的蔗糖分解酶（CWIN、VIN、CIN和Sus）活性与碳水化合物（淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖）含量进行相关性分析,结果表明Sus活性和淀粉含量之间呈极显著正相关（表1）,而VIN、CIN活性和葡萄糖、果糖含量呈显著正相关。
此外,值得注意的是,与CIN和VIN相反,CWIN活性与己糖（葡萄糖和果糖）含量之间呈显著负相关关系（表1）。
表1 甘薯块根中蔗糖分解酶活性与碳水化合物含量之间的相关性分析Tab. 1 Correlation analysis between the activities of sucrose-degrading enzymes and the content of carbohydrates in storage root of sweet potato cultivars |
| 蔗糖分解酶 Sucrose-degrading enzymes | 葡萄糖 Glu | 果糖 Fru | 蔗糖 Suc | 淀粉 Starch |
|---|---|---|---|---|
| CWIN | -0.884* | -0.930** | 0.871* | - |
| VIN | 0.853* | 0.841* | -0.815* | - |
| CIN | 0.869* | 0.875* | -0.822* | - |
| Sus | - | - | -0.773* | 0.921** |
Note: * and ** indicate significant difference (P<0.05) or extremely significant difference (P<0.01). | |
注：*和**分别表示差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。 |
3 讨论
转化酶（VIN和CIN）可将蔗糖水解为果糖和葡萄糖[6],从而提高植物储藏器官中的己糖（葡萄糖和果糖）含量[14,15]。和‘苏薯17’相比,‘商薯19’具有更高的VIN和CIN活性（图3A）,这可以解释为什么‘商薯19’块根比‘苏薯17’块根具有更高的己糖含量。对2个品种块根中己糖含量与VIN活性以及CIN活性之间的相关性分析表明,块根中的己糖含量与VIN和CIN活性之间均呈显著正相关。前人的研究只是揭示出VIN与甘薯块根中己糖含量呈正相关,但不清楚CIN对己糖含量的影响[22]。CIN活性在大多数植物器官中非常低,例如番茄果实[27]和豇豆种子[28]。因此,和VIN相比,人们对CIN的研究较少,尚不明确其在植物中的具体功能。本研究不仅发现CIN在甘薯块根中活性非常高,是甘薯块根中主要的转化酶种类,而且揭示出其活性和块根己糖含量之间呈显著正相关,是调节甘薯己糖含量的重要酶类。
需要特别指出的是,相关性分析表明,CWIN活性与块根中己糖含量呈显著负相关（表1）,这与CIN和VIN上的研究结果正好相反,原因可能是由于CWIN在块根中的活性相对较低,只有CIN或VIN活性的10%~25%左右,因此CWIN可能不是影响块根己糖含量的主要转化酶类。研究表明,CWIN在植物中的功能主要有2个。一是CWIN通过分解“库”器官中的蔗糖,在光合叶片和“库”之间形成一个从高到低的浓度梯度,从而促进蔗糖向“库”器官的转运[9]。二是CWIN促进蔗糖的“回收利用”,即CWIN可将从共质体运输途径中“泄露”出来的蔗糖分解为己糖（葡萄糖和果糖）,然后这些己糖再被细胞膜上的己糖载体转运进入细胞质中用于植物的生长发育[29]。然而,有关CWIN在甘薯块根发育中的具体生物学功能还有待于进一步的研究和分析。
总之,本研究通过对2个甘薯品种块根中淀粉和可溶性糖含量以及4种蔗糖分解酶活性的测定和比较分析,初步揭示：1）甘薯块根中主要的蔗糖分解酶为Sus,其次为CIN和VIN,而CWIN活性最低。2）蔗糖分解酶对甘薯品质有重要影响,其中Sus是调控甘薯块根淀粉含量的关键酶类,而CIN和VIN是调控块根中己糖含量的关键酶类。