沉香为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）或拟沉香属（Gyrinops）植物含有树脂的芯材[1]。据《中国药典》记载,在两千多年前的传统中医学、藏医学、传统印度医学中沉香就被入药使用;沉香味辛,性微温,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效[2]。现代药理研究表明,沉香具有镇静安神、调血脂、抗癌、抗菌和抗炎等作用[3]。由于其疗效确切而被中医临床各科广泛应用[5]。
迄今为止,全世界共发现23种沉香属植物,国内分布的仅有白木香[A. sinensis (Lour.) Gilg.]和云南沉香（A. yunnanensis S. C. Huang）,均为中国特有种。沉香可分为国产沉香与国外沉香,国产沉香指基源植物白木香[A. sinensis (Lour.) Gilg.]所产的沉香,主要产于海南、广东、广西等地。国外沉香是指分布在中国之外的沉香基源植物所产的沉香,主要产于印尼、越南、马来西亚等地[6]。目前,对来源于白木香[A. sinensis (Lour.) Gilg.]、马来沉香树（A. malaccensis Lam）、柯拉斯那沉香树（A. crassna Pierre ex Lecomte）等基源植物所产沉香的研究较多,其他沉香属植物所产沉香则少有报道。
目前国内外研究发现沉香的主要特征性化学成分为倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮类化合物[6,7]。迄今为止,从沉香中分离得到的2-(2-苯乙基)色酮类化合物已达100多个[1],其中主要有以下6种类型：fidersia型2-(2-苯乙基)色酮[8],2-(2-苯乙烯基)色酮[9],环氧5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮[8]、5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮[10],2-(2-苯乙基)色酮聚合物[11]和2-(2-苯乙基)色酮糖苷[12]等。
为了科学利用沉香资源,本研究组对一种国外沉香属植物所产沉香的2-(2-苯乙基)色酮类化合物进行研究,以比较该国外沉香与其他沉香属植物所产沉香的异同。利用柱色谱与高效液相色谱等手段从中分离得到6个化合物,其中化合物1为新的含氯取代的2-(2-苯乙基)色酮。并采用MTT法对化合物2~6进行细胞毒活性测试,结果表明化合物2、3、5、6均具有一定的细胞毒抑制活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 沉香样品于2014年8月购自泰国曼谷,经中国热带农业科学院热带生物技术研究所王军博士鉴定其基源植物为沉香属（Aquilaria sp.）植物,凭证标本（201408SLLK）存放在中国热带农业科学院热带生物技术研究所标本室。
1.1.2 仪器与试剂 Bruker AV-500型超导核磁仪（瑞士Bruker公司）,HR-ESI-MS质谱仪（瑞士Bruker公司）,SUMMIT P680A半制备型高效液相色谱仪（美国Dionex公司）,YMC-packed色谱柱 （C18,250 mm×4.6 mm,ID,日本YMC公司）,Agilent 1260分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）,旋转蒸发仪（德国Heidolph Laborota公司）,SW-40洁净工作台（上海博讯实业有限公司）,GALAXYR CO2培养箱（英国RS Biotech公司）,HVE-50高压蒸汽灭菌锅（日本HIRATAMA公司）和ELX-800酶标仪（美国宝特公司）。
Sephadex LH-20（德国Merk公司）,薄层色谱硅胶板和柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）,ODS反相硅胶材料（Fuji Silysia Chemical Ltd.公司）,国产AR级有机试剂（广州化工）,高效液相色谱纯试剂（天津科密欧）,DMSO（西陇化工股份有限公司）,人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402、人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela和人肺癌细胞A549（中国科学院上海生命科学研究所细胞库）,盐酸阿霉素（上海士锋生物科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 提取与分离 干燥粉碎的沉香芯材（384.0 g）用乙醚提取,残渣再用工业乙醇（3 L×3次）加热回流提取、浓缩,得到乙醇提取物（129.0 g）。将乙醇提取物用水分散成悬浊液,用乙酸乙酯萃取（3 L×3次）后得到乙酸乙酯萃取物（107.8 g）,分离流程过程见图1。
将乙酸乙酯萃取物（107.8 g）以氯仿-甲醇（200:1~15:1）在硅胶柱色谱上进行梯度洗脱,得到11个流分（Fr. 1~Fr. 11）。Fr. 3（2.8 g）经Sephadex LH-20（3×150 cm）,用氯仿-甲醇（1:1, V/V）洗脱,得到3个流分（Fr. 3.1~Fr. 3.3）。Fr. 3.39（1.4 g）经Sephadex LH-20（3×150 cm）,用氯仿-甲醇（1:1, V/V）洗脱,得到5个流分（Fr. 3.3.1~3.3.5）。Fr. 3.3.4（89.2 mg）经硅胶柱色谱,得到5个流分（Fr. 3.3.4.1~3.3.4.5）。Fr. 3.3.4.5 （36.5 mg）通过半制备高效液相色谱仪（C18色谱柱;流速4 mL/min;柱温(25±2) ℃;检测波长230、254 nm）,得到化合物4（2.1 mg）和5（2.0 mg）。Fr. 4（13.3 g）经ODS柱色谱,以甲醇-水（3:7→1:0）梯度洗脱,得到8个流分（Fr. 4.1~4.8）。Fr. 4.5（8.7 mg）通过半制备高效液相色谱仪（C18色谱柱;55%甲醇/水流动相;流速4 mL/min;柱温(25±2) ℃;检测波长200, 220 nm）,得到化合物2（1.1 mg）和化合物6（2.8 mg）。Fr. 4.6（1.0 g）经Sephadex LH-20（3×150 cm）,用氯仿-甲醇（1:1,V/V）洗脱,得到4个流分（Fr. 4.6.1~4.6.4）。Fr. 4.6.4（99.4 mg）经硅胶柱色谱,得到5个流分（Fr. 4.6.4.1~4.6.4.5）。Fr. 4.6.4.4 （22.2 mg）通过半制备高效液相色谱仪（C18色谱柱;60%甲醇/水流动相;流速4 mL/min;柱温(25±2)℃;检测波长210、236 nm）,得到化合物1（0.6 mg）。Fr. 4.7（5.7 g）经Sephadex LH-20经Sephadex LH-20（3×150 cm）,用氯仿-甲醇（1:1, V/V）洗脱,得到4个流分（Fr. 4.7.1~4.7.4）。Fr. 4.7.3（3.7 g）经Sephadex LH-20（3×150 cm）,用石油醚-氯仿-甲醇（2:1:1,V/V/V）洗脱,得到4个流分（Fr. 4.7.3.1~4.7.3.4）,Fr. 4.7.3.3 （2.7 g）经硅胶柱色谱,得到7个流分（Fr. 4.7.3.3.1~4.7.3.3.7）。Fr. 4.7.3.3.3 （1.6 g）经ODS柱色谱,以甲醇-水（3:7→1:0）梯度洗脱,得到9个流分（Fr. 4.7.3.3.3.1~4.7.3.3.3.9）。Fr. 4.7.3.3.3.1（128.3 mg）通过半制备高效液相色谱仪（C18色谱柱;30%甲醇/水流动相;流速4 mL/min;柱温(25±2)℃;检测波长220、254 nm）,得到化合物3（1.4 mg）。
1.2.2 化合物的结构鉴定方法 （1）核磁共振谱：用适量的氘代试剂（约0.5 mL）溶解纯化合物,并转移到核磁管中进行核磁共振测试。常用的氘代试剂有CDCl3、CD3OD、CD3COCD3、DMSO等。
（2）质谱：用色谱级甲醇溶解微量样品,过0.45 µm微孔膜后,用进样针吸取少量样品溶液注入质谱仪中,采集信息。质谱条件：阳离子采集模式,采集二级质谱,扫描范围m/z 70~2200,氮气流速6.0 L/min,干燥气体温度为250 ℃,雾化气压力15 psi,毛细管压力4000 V。
（3）红外光谱（IR）：在红外灯下研磨溴化钾,并用粉末压片机将其压成透明的溴化钾片;将溶于适量易挥发有机溶剂的样品滴到溴化钾片上,挥去溶剂后在红外光谱仪上进行测定。
（4）紫外光谱（UV）：将样品溶于适宜溶剂并配成适当浓度（一般20 µg/mL）,测试前先用溶剂做空白对紫外分光光度计进行调零,然后将溶液倒入石英比色皿,在400~190 nm波长下扫描,记录吸收值。
1.2.3 细胞毒活性测试方法 对从该种国外沉香中分离得到的化合物2~6进行细胞毒活性测试,测试方法参照文献报道的MTT[13]法,用盐酸阿霉素溶液作为阳性对照,以人肺腺癌细胞A549、人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL、人胃癌细胞SGC和人宫颈癌细胞Hela细胞为指示瘤株。样品活性结果以半数抑制浓度（IC50）表示,当抑制率为50%时的样品质量浓度就是细胞毒活性的IC50值。
1.3 数据处理
采用Excel 2010软件和SPSS 16软件计算化合物2~6的细胞毒抑制活性的半数抑制浓度IC50值及标准差。
2 结果与分析
2.1 结构鉴定
化合物1：黄色固体;高分辨质谱 (+)HR- SI-MS显示准分子离子峰m/z: 339.0397([M+Na]+, calcd. C17H13ClNaO4 339.0395)和m/z: 341.0371 ([M+2+Na]+)的相对丰度比值约为3:1,表明化合物含有一个氯原子,化合物的分子式为C17H13ClO4。紫外光谱上331(2.9)、229(3.5)、216(3.4) nm的吸收峰与2-(2-苯乙基)色酮类化合物的紫外吸收峰相似,表明该化合物为2-(2-苯乙基)色酮类化合物。1H NMR(500MHz, CD3OD)显示1个单峰δH 6.10(1H, s),为2-(2-苯乙基)色酮3位质子的特征信号;最低场互相偶合的两个质子信号δH 7.33(1H, d, J = 2.9 Hz)和δH 7.31(1H, d, J = 2.9 Hz)表明2-(2-苯乙基)色酮5位和7位或者6位和8位被取代;低场区另外一组互相偶合的质子δH 7.03(2H, d, J = 8.5 Hz)和δH6.68(2H, d, J =8.5 Hz)为对位二取代苯环的特征信号,表明2-(2-苯乙基)色酮的4°位被取代;高场区δH 2.98~2.32为色酮上7°和8°位4个质子重叠的信号。综上所述,可以确定该化合物是被一个氯原子和两个羟基取代的2-(2-苯乙基)色酮。由于化合物量少,未能测得该化合物的13C NMR和2D NMR。目前已报道的氯代2-(2-苯乙基)色酮类化合物中氯原子的取代位置均在8位,综合2-(2-苯乙基)色酮类化合物的生源关系,再与化合物6-羟基-8-氯-2-[2-(4°-甲氧基苯基)乙基]色酮[14]对比1H NMR数据,发现二者的1H NMR数据非常相似（见表1）,不同之处在于化合物1没有甲氧基的信号,因此推测其4°位被羟基所取代,为6-羟基-8-氯-2-[2-(4°-羟基苯基)乙基]色酮,结构如图2所示。
表1 化合物1和6-羟基-8-氯-2-[2-(4°-甲氧基苯基)乙基]色酮的1H NMR数据（500 MHz, CD3OD）Tab. 1 1H NMR (500 MHz, CD3OD) data of compound 1 and 6-hydroxy-8-chloro-2-[2-(4°-methoxyphenyl) ethyl] chromone |
| 位置 Position | 化合物1 Compound 1 | 6-羟基-8-氯-2-[2-(4°- 甲氧基苯基)乙基]色酮 6-Hydroxy-8-chloro-2-[2-(4°-methoxyphenyl)ethyl]chromone |
|---|---|---|
| δH (J in Hz) | δH (J in Hz) | |
| 3 | 6.10, s | 6.08, s |
| 5 | 7.30, d (2.9) | 7.37, d (2.8) |
| 7 | 7.28, d (2.9) | 7.35, d (2.8) |
| 2° | 7.03, d (8.5) | 7.19, dd (6.4, 2.0) |
| 3° | 6.68, d (8.5) | 6.82, dd (6.4, 2.0) |
| 5° | 6.68, d (8.5) | 6.82, dd (6.4, 2.0) |
| 6° | 7.03, d (8.5) | 7.19, dd (6.4, 2.0) |
| 7° | 2.99~3.01, m | 2.99~3.00, m |
| 8° | 2.99~3.01, m | 3.01~3.05, m |
| OMe-4° | 3.70, s | |
| OH-6 | 9.40, s |
化合物2：黄色粉末状;ESI-MS在m/z: 313.3[M+H]+;结合NMR谱数据推断分子式为C18H16O5;1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6.10 (1H, s, H-3),7.37 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-5),7.24 (1H, dd, J = 9.0, 3.0 Hz, H-7),7.46 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-8),6.63 (1H, dd, J = 8.0, 1.9 Hz, H-6°),6.75 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2°),6.68 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5°),3.73 (3H, s, OMe-4°),2.93-3.01 (4H, m, H-7°, 8°)。13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 171.4 (C-2),109.7 (C-3),180.5 (C-4),108.6 (C-5),156.4 (C-6),124.4 (C-7),120.4 (C-8),152.0 (C-9),125.0 (C-10),132.7 (C-1°),113.0 (C-2°),148.8 (C-3°),146.5 (C-4°),116.1 (C-5°),121.8 (C-6°),33.7 (C-7°),37.4 (C-8°),56.1 (OMe-4°)。以上数据与文献[10]报道基本一致,故鉴定该化合物2为6-羟基- 2-[2-(3°-甲氧基-4°-羟基苯基)乙基]色酮,结构见图3。
化合物3：黄色粉末状;ESI-MS在m/z: 313.3处给出[M+H]+峰;结合NMR谱数据推断分子式为C18H16O5;1H NMR(500 MHz, CD3OD) δ: 6.05 (1H, s, H-3),7.35 (1H, s, H-5),7.10 (1H, s, H-8),7.02 (1H, d, J = 8.5, H-2°, 6°),6.68 (1H, d, J = 8.5, H-3°, 5°),2.97 (2H, m, H-7°),2.92 (2H, m, H-8°),4.00 (3H, s, OMe-7)。13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ : 170.9 (C-2),109.8 (C-3),180.1 (C-4),108.4 (C-5),146.7 (C-6),155.6 (C-7),100.8 (C-8),153.6 (C-9),117.8 (C-10),132.1 (C-1°),130.4 (C-2°, 6°),116.3 (C-3°, 5°),157.0 (C-4°),33.4 (C-7°),37.4 (C-8°),57.0 (OMe-7)。以上数据与文献[10]报道基本一致,鉴定化合物3为6-羟基-7-甲氧基-2-[2-(4°-羟基苯乙基)乙基]色酮,结构见图3。
化合物4：白色粉末状;ESI-MS在m/z: 319.3处给出 [M + H]+峰;结合NMR谱数据推断分子式为C17H18O6;1H NMR (500MHz, CD3OD) δ: 6.12 (1H, s, H-3),4.56 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5),4.04 (1H, dd, J = 7.5, 2.3 Hz, H-6),4.01 (1H, dd, J = 4.0, 2.3 Hz, H-7),4.74 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-8),7.23 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2°, 6°),7.27 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-3°, 5°),7.18 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-4°);3.04 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-7°),2.90-2.96 (2H, m, H-8°)。13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 171.2 (C-2),114.1 (C-3),181.9 (C-4),70.1 (C-5),74.0 (C-6),72.4 (C-7),66.7 (C-8),165.4 (C-9),121.8 (C-10),141.2 (C-1°),129.6 (C-2°, 6°),129.5 (C-3°, 5°),127.4 (C-4°),33.7 (C-7°),36.3 (C-8°)。以上数据与文献[15]报道基本一致,故鉴定化合物4为沉香四醇,结构见图3。
化合物5：黄色粉末状;ESI-MS在m/z: 353.3 [M+H]+,结合NMR谱数据推断分子式为C18H20O7;1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6.10 (1H, s, H-3),4.56 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5),4.04 (1H, dd, J = 7.5, 2.3 Hz, H-6),4.01 (1H, dd, J = 4.0, 2.3 Hz, H-7),4.74 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-8),7.13 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2°, 6°),6.83 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3°, 5°),2.97 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-7°),2.86-2.92 (2H, m, H-8°),3.75 (3H, s, OMe-4°)。13C NMR (125 MHz, CD3 OD) δ: 171.4 (C-2),114.1 (C-3),181.9 (C-4),70.1 (C-5),74.0 (C-6),72.4 (C-7),66.7 (C-8),165.4 (C-9),121.7 (C-10),133.1 (C-1°),130.4 (C-2°, 6°),114.9 (C-3°, 5°),159.7 (C-4°),32.9 (C-7°),36.6 (C-8°),55.6 (OMe-4°)。以上数据与文献[15]报道基本一致,故鉴定化合物5为5α,6β,7β,8α-四羟基-2-[2-(4°-甲氧基苯基)乙基]-5,6,7,8-四氢色酮,结构见图3。
化合物6：白色粉末状;ESI-MS在m/z: 333.3处给出[M+Na]+峰;结合NMR谱数据推断分子式为C18H14O5;1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 6.27 (1H, s, H-3),7.27 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-5),7.22 (1H, dd, J = 8.9, 3.0 Hz, H-7),7.53 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-8),7.29 (1H, brs, H-2°),6.79 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-5'),7.12 (1H, brd, J = 7.7 Hz, H-6'),7.55 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7°),6.96 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8°),3.83 (3H, s, OMe-3°)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ : 162.6 (C-2),107.9 (C-3),176.8 (C-4),107.7 (C-5),149.1 (C-6),122.8 (C-7),119.3 (C-8),154.8 (C-9),124.5 (C-10),128.7 (C-1°),110.7 (C-2°),148.2 (C-3°),149.2 (C-4°),117.0 (C-5°),122.6 (C-6°),136.9 (C-7°),115.8 (C-8°),55.7 (OMe-3°)。以上数据与文献[10]报道基本一致,故鉴定化合物6为6-羟基-2-[2-(3°-甲氧基-4°-羟基苯基)乙烯基]色酮,结构见图3。
2.2 细胞毒活性测试结果
对化合物2~6进行细胞毒活性测试,具体结果见表2。
表2 化合物2~6的细胞毒活性测试结果Tab. 2 The results of cytotoxicity test of the compounds 2-6 |
| 肿瘤细胞株 Tumor cell line | 半数抑制浓度IC50/(μg·mL-1) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照（盐酸阿霉素） Control (paclitaxel) | 化合物2 Compound 2 | 化合物3 Compound 3 | 化合物4 Compound 4 | 化合物5 Compound 5 | 化合物6 Compound 6 | |
| K562 | 7.93±0.66 | 13.20±0.80 | 45.38±1.84 | — | — | 2.87±0.01 |
| BEL-7402 | 6.47±0.37 | 25.91±0.41 | — | — | 35.11±0.43 | 4.75±0.19 |
| SGC-7901 | 3.62±0.20 | 23.51±0.14 | 35.42±1.44 | — | 32.95±0.87 | 9.91±0.09 |
| A549 | 14.77±0.28 | 22.00±0.90 | 33.31±0.68 | — | — | 22.43±0.40 |
| Hela | 6.29±0.18 | 30.55±3.04 | — | — | — | 13.86±0.13 |
Note: The data in the table is expressed as mean ± standard deviation, n=3. | |
注：表中数据以平均值±标准差表示,n=3。 |
3 讨论
本研究通过对一种国外沉香的2-(2-苯乙基)色酮类化合物的研究,从其乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定了6个化合物,包括1个新的含氯取代的2-(2-苯乙基)色酮（1）,2个fidersia型2-(2-苯乙基)色酮（2和3）,2个5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮（4和5）和1个2-(2-苯乙烯基)色酮（6）。本文从该国外沉香中分离鉴定出2-(2-苯乙基)色酮类化合物,其中包含4种具有代表性的2-(2-苯乙基)色酮类型。表明该国外沉香与其他沉香属植物所产沉香中2-(2-苯乙基)色酮类型基本一致。
本研究对化合物2~6的细胞毒活性测试结果显示,化合物6对5株人体肿瘤细胞均表现出一定抑制活性,其中对人慢性髓原白血病细胞K562和人肝癌细胞BEL-7402具有显著抑制活性,半数抑制浓度（IC50）分别为2.87、4.75 μg/mL,化合物4无明显活性。化合物2、3、5对5株人体肿瘤细胞表现出中等活性,半数抑制浓度（IC50）范围为9.91~45.38 μg/mL。据文献报道,2-(2-苯乙烯基)色酮类化合物具有较好的细胞毒活性[18]。在后续工作中,笔者将对该国外沉香中分离得到其他2-(2-苯乙基)色酮类化合物开展进一步活性筛选研究。