台湾相思（Acacia confusa Merr.）属于金合欢属含羞草科,是一种原产于中国台湾南部的常绿乔木,其生长迅速,耐干旱,有根瘤,具有固氮作用,可改良土壤, 对提升土壤肥力有着很好的作用,且具有木材用途广等特性,适用于荒山造林、是沿海防护林的先锋树种[1,2,3]。相思树树冠苍翠浓绿,抗风性强,是行道树、遮荫树、园景树、护坡树、防风树的优良树种,而且维护成本低。近年来,随着造林面积的不断扩大,笔者调查中发现相思树上发生的病害不断加重,其中根腐病最为严重。笔者在对海南省各市县的相思树林地进行病害调查中发现,一些整株发病枯死或接近死亡的台湾相思树其茎干基部和近地表的根系上长出假芝属的担子果,病根木质部组织呈现黄白色湿腐,将此病害取名为假芝根腐病。
假芝属（Amauroderma）由美国真菌学家William Alphonso Mur rill于1905年建立, 指定模式种为Amauroderma schomburgkii =Fomes regulicolor[4]。假芝属真菌主要分布于热带和亚热带地区,在我国华南和西南的部分地区分布较多。我国假芝属的分类学研究始于邓叔群先生,共记录了我国假芝属的10个种和1个变型。1980年以来,赵继鼎等对我国的假芝属作了大量的工作,他们一系列研究报道了产于我国的二孢假芝（A. subresinosum）、厦门假芝（A. amoiense）、耳匙假芝（A. auriscalpium）、华南假芝（A. austrosinense）等22个种[5,6,7],秦改娟等也报道了我国的1个新记录种（A. subrugosum）[8]。戴玉成等报道曾在海南五指山市等地方有大量的台湾相思树死亡,详细调查后发现其病原菌为热带灵芝 [Ganoderma tropicum (Jungh.) Bres.]和粗柄假芝（A. elmerianum Murrill.）[9],谭象生等也报道热带灵芝可以导致台湾相思树根部腐烂[10]。但未见有假芝属真菌引起活立木根腐病的致病性及生物学特性等的进一步研究。因此,本研究从海南省定安、临高、澄迈、儋州等地的发病台湾相思病株上取样,对其病原菌的致病性、种类鉴定及生物学特性等进行深入研究,旨在进一步明确该病害的假芝属真菌种类,为摸清其发生流行规律及综合防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本及接种苗木 2015—2017年从海南省定安县南丽湖南海农场、临高、澄迈、儋州等地发病的台湾相思（A. confusa Merr.）病株的根茎部采集新鲜担子果样本10份,样品均用保鲜袋包装后带回实验室备用。致病性测定所用耳叶相思（A. auriculiformis A. Cunn. ex Benth.）、马占相思（A. mangium Willd.）及台湾相思（A. confuse Merr.）幼苗由海南大学热带农林学院提供。
1.1.3 试剂及仪器 E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit、Omega Gel Extraction Kit、2×Taq-Mixture、DNA Marker 2000,美国Omega Bio-Tek公司。Olympus BX 51 显微镜。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离培养 利用常规组织分离法,从采集的新鲜担子果上分离菌株,先用70%的酒精对担子果表面消毒,再用灭完菌的手术刀把担子果边缘表皮削除,用灭菌的镊子夹取带菌管处的菌肉接种到PDA 上,28 ℃恒温培养,分离菌株纯化后转入PDA培养基作为菌种保存备用,编号为HNDA005。
1.2.2 接种体的制备 在纯化后的HNDA005菌株菌落边缘挑取边长1 cm的正方形大小菌丝块放置于已灭菌的袋装木屑培养基中制备接种体,放置到28 ℃培养箱进行恒温黑暗培养15~20 d,直至菌丝布满整个培养基。用放置空白琼脂块的木屑培养基作为空白对照。
1.2.3 菌株的致病性测定 先在待接种植株台湾相思树、耳叶相思和马占相思树的茎干表面喷70%酒精进行表面消毒,再用灭菌手术刀对待接种植株进行轻微创伤,将布满HNDA005菌株菌丝的接种体紧紧贴在切口处,并用湿棉花进行保湿,最后用保鲜膜缠绕固定。每个处理设置3个重复,对照株用同样的方法接空白木屑培养基。接种后每隔10 d对苗木长势和侵染情况进行观察,并进行拍照记录。接种方法参照高秀兵等[12]方法,略作改动。
1.2.4 担子果诱导 挑取纯化后的边长1 cm的正方形菌株菌丝块放置于已灭菌的瓶装木屑培养基中进行担子果诱导,放置到室内对其进行保湿,定时观察。
分子鉴定：将菌株培养7 d后用液氮研磨收集的100 mg菌丝,使用OMEGA Fungal DNA Kit来提取DNA。采用通用引物 NS1（5′-GTAGT CATATGCTTGTCTC-3′）和NS4（5′-CTTCCGTCA ATTCCTTTAAG-3′）[15]扩增核糖体小亚基基因序列,引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。扩增产物在恒压150 V下用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。使用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒切胶回收目的片段,纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序获得的SSU序列在NCBI上进行BLAST比对分析,并提交序列。利用 MEGA 6.0软件以邻接法（neighbor-joining,NJ）,构建系统发育树[16]。
1.2.6 生物学特性测定 菌株HNDA005培养6 d后用直径5 mm 的打孔器对其菌落边缘打取菌饼,并将菌饼接种各供试培养基进行培养,十字交叉法测量菌落直径。各培养基设置3个重复。除碳、氮源生物学测定外,其他条件所使用的培养基均为PDA培养基。
温度：将菌柄接种PDA培养基后置于10、15、20、25、28、30、32、35、40 ℃共9个温度梯度下恒温黑暗培养。
光照：测定条件设置为完全黑暗、日光灯连续照射、12 h光暗交替3种条件,28 ℃恒温培养。
pH：在已灭菌的PDA培养基凝固之前,用 1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10个梯度,28 ℃恒温培养。
碳、氮源：分别称取等质量的葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉、肌醇、D-山梨醇作为碳源;称取等质量的酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉膏、L-天冬酰胺、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钙、硝酸钠、硝酸钾作为氮源;分别替换Czapek培养基中的碳、氮源,设三组重复接菌饼进行测定。将不加蔗糖、硝酸钠的Czapek培养基作为缺碳、缺氮空白对照。
1.3 数据处理
利用Excel 2010软件和SAS 9.1软件进行数据统计分析,采用Duncan’s multiple range test进行多组样本间差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 台湾相思假芝根腐病症状
发病的台湾相思树最初的表现为叶片失绿、发黄,继而枯黄脱落,树冠变稀疏,生长不良、枯枝多、重病株全株干枯死亡,病株易被强风连根吹倒。病根表面变黑,木质部组织呈黄白色海绵状湿腐,在发病植株的茎干基部、近地面的病根上长出新鲜的灰褐色或灰黑色担子果,担子果下表面灰白色,用手指按压或受其他机械伤后很快变为血红色（图1）。
图1 田间症状A 、B：田间植株发病症状; C：病根木质部组织白腐;D~F：病树茎干、茎基部和地表长出的担子果;G：担子果下表面伤变呈血红色。 Fig. 1 Field symptoms A, B: Symptoms of field plants;C: Diseased tree xylem tissue white rot;D-F: Basidiocarps grow on the surface and the stem and stem base of diseased trees; G: The under surface of the basidiocarp turns blood red after injury. |
2.2 致病性测定
3个月后检查接种了HNDA005菌株的台湾相思树受侵染情况,结果发现接种后的台湾相思树叶子枯黄,树冠稀疏;4个月后整株枯死,接种菌从接种部位侵入木质部并扩展,接种点处的茎干组织变黑褐色,周围组织白腐,与田间发病症状相同,对照组创伤后的伤口已愈合,植株无明显变化。采发病组织进行分离获得相同的菌株,表明分离菌为致病菌。马占相思和耳叶相思树致病性测定结果同上。
2.3 担子果诱导
用HNDA005菌株接种木屑培养基,5个月后生长出与病株上采集的形态相同的担子果（图3）。
2.4 病原菌的鉴定
图4 病原菌形态A：病原菌在PDA培养基上生长6 d的菌落;B：病原菌在PDA培养基上生长90 d后长出的幼嫩担子果;C、D、E：新鲜的担子果;F：干燥的担子果;G：菌丝（①骨架菌丝;②缠绕菌丝;③生殖菌丝）;H：担孢子。 Fig. 4 Morphology of pathogen A: Pathogen’s colony morphology on PDA medium for 6 days; B: Young basidiocarp of pathogen grown on PDA medium for 90 days; C,D,E: Fresh basidiocarp; F: dried basidiocarp; G: Hyphae (①Skeletal hyphae; ②Bindinghyphae; ③Generative hyphae); H: Basidiospores. |
担子果：担子果1年生,有柄,木栓质。菌盖肾形、半圆形或圆形,新鲜时软木栓质,干燥后变硬为木质,质量明显变轻,大小为(4.8~8.5)cm× (4.8~10.0)cm,厚0.3~1.2 cm。菌盖上表面灰褐色、污褐色、暗褐色至黑褐色或黑色,无光泽,干燥后呈黑褐色,有显著的同心环带和放射状皱纹,被青灰色微绒毛,无漆样光泽;边缘钝或呈截形,有时薄,波浪状,稍内卷。菌肉呈淡褐色或较深的灰色,有时呈污白色,但比菌管色淡,厚1.5~9.6 mm;菌管暗褐色至深褐色,长1.8~5.2 mm;担子果下表面新鲜时呈灰白色,触摸受伤后迅速变为血红色,最后变为黑褐色或黑色;管口近圆形或稍不规则形,每毫米4~6个;菌柄侧生、中生或偏生,圆柱形,与菌盖同色,有时分叉,近光滑或有细微绒毛,长5~10 cm,直径0.28~1.5 cm,有假根,有时分叉（图4C~图4F）。
2.4.2 rDNA-SSU序列比对 测序后获得HNDA005菌株的rDNA-SSU序列为534 bp,NCBI在线Blastn比对所得SSU序列（NCBI登录号为MH543323）与NCBI登录号为HM480839.1等的假芝（Amauroderma rugosum）序列的相似度最高,达98%。将HNDA005菌株SSU序列与GenBank中已有的SSU基因序列进行同源性比较,利用MEGA6.0软件构建系统进化树,分析同源关系。结果显示,HNDA005菌株的rDNA-SSU序列与假芝的同源性最高,表明该病原菌HNDA005与假芝遗传距离最小,聚为一类（图4）。结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果,确定该病原菌为假芝[Amauroderma rugosum (Bl.et Nees) Torrend]。
2.5 生物学特性
2.5.1 温度对假芝菌丝生长的影响 不同温度对菌株菌落生长的影响差异显著。当温度在 15~40 ℃之间,病原菌HNDA005菌株菌丝均能生长,适宜生长温度为25~35 ℃,最适生长温度为32 ℃, 到10 ℃时停止生长,但是并未死亡,转移至适宜温度时可继续生长（图6）。
2.5.2 光照对假芝菌丝生长的影响 在不同光照条件处理下,病原菌HNDA005菌株菌丝生长速度差异较小,在连续光照条件下菌丝生长速度最快,菌落边缘整齐,菌丝中间褐色边缘白色,致密,生长均匀,在完全黑暗条件下生长最慢（图7）。
2.5.3 pH对假芝菌丝生长的影响 不同pH条件对菌株菌落生长的影响差异显著。病原菌HNDA005菌株的菌丝在pH 2时生长缓慢,pH 3~4时菌丝生长速率增快,pH 5时菌落直径极显著高于其他处理,表明pH 5最适宜菌丝生长（图8）,表明该病原菌在弱酸性环境中生长要比在碱性环境中好。
2.5.4 碳、氮源对假芝菌丝生长的影响 供试的8种碳源培养基均能够显著促进病原菌HNDA005菌株菌丝生长,其中在以D-果糖为碳源的菌落直径最大,且其菌丝致密,菌落近圆形,长势优良;其次为可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖上菌落较大,长势一般;在肌醇和D-山梨醇中菌落直径最小,且菌落稀薄,碳源的利用率低。表明该病菌菌丝对不同的碳源或者不同种类的同类型碳源的利用率存在差异（表1）。
表1 碳源对假芝菌丝生长的影响Tab. 1 Effect of different carbon sources on mycelial growth of A. rugosum |
| 氮源 Nitrogen source | 菌落直径 Colony diameter/cm | 菌落特征 Colony characteristics |
|---|---|---|
| D-果糖 D-Fructose | 7.72±0.07aA | 菌丝乳白色致密,菌落近圆形,长势优良 |
| 可溶性淀粉 Soluble starch | 6.40±0.05bB | 菌丝乳白色,菌落扇形,长势一般 |
| 葡萄糖 Glucose | 6.22±0.07cC | 菌丝乳白色,菌落扇形,长势一般 |
| 蔗糖 Sucrose | 6.10±0.08cdCD | 菌丝乳白色,菌落近圆形,长势一般 |
| 麦芽糖 Malt dust | 6.00±0.05dD | 菌丝乳白色,菌落近圆形,长势一般 |
| 肌醇 Inositol | 5.55±0.10eE | 菌落近圆形,较透明, 长势极差 |
| D-山梨醇 D-Sorbitol | 4.28±0.05gG | 菌丝乳白色,菌落扇形,长势一般 |
| 对照 CK | 5.28±0.07fF | 菌落不规则形,较透明, 长势极差 |
Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. Different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level. | |
注：不同小写字母表示0.05水平上的差异显著,不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著。 |
供试的12种氮源培养基对病原菌 HNDA005 菌株菌丝生长的影响存在一定的差异,单一氮源以硝酸钙为氮源的菌落直径最大,其次为硝酸铵。草酸铵为氮源的菌落直径最小。在缺氮元素的培养基中,菌丝稀薄。复合氮源中酵母浸膏菌落直径最大,菌落圆形,致密。表明病原菌对不同的氮源利用率存在差异（表2）。
表2 氮源对假芝菌丝生长的影响Tab. 2 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of A. rugosum |
| 氮源 Nitrogen source | 菌落直径 Colony diameter/cm | 菌落特征 Colony characteristics |
|---|---|---|
| 酵母浸膏 Yeast extract | 7.28±0.05aA | 菌落近圆形,中心深褐色边缘乳白色,菌丝致密 |
| 大豆蛋白胨 Soya peptone | 6.62±0.06bB | 菌落近圆形,中心深褐色边缘乳白色,菌丝致密 |
| L-天冬酰胺 L-Asparagine | 6.35±0.03cC | 菌落乳白色,菌落扇形,长势一般 |
| 牛肉浸膏 Beef extract | 5.92±0.07dD | 菌落近圆形,中心深褐色边缘乳白色,菌丝致密 |
| 硝酸钙 Calcium nitrate | 5.77±0.07deDE | 菌丝白色不规则,长势差 |
| 硝酸铵 Ammonium nitrate | 5.76±0.02defDEF | 菌丝白色,菌落不规则形,长势差 |
| 硝酸钾 Potassium nitrate | 5.71±0.07efgDEFG | 菌丝层较厚且厚薄均匀,长势优良 |
| 硫酸铵 Ammonium sulphate | 5.70±0.05fghEFG | 菌丝白色扇形,长势差 |
| 硝酸钠 Sodium nitrate | 5.67±0.03fghFG | 菌丝白色,菌落近圆形,长势差 |
| 氯化铵 Ammonium chloride | 5.55±0.08ghFG | 菌丝层近透明;长势差 |
| 草酸铵 Ammonium oxalate | 5.41±0.06hG | 菌丝白色,菌落雪花状,长势较差 |
| 对照 CK | 5.58±0.06iH | 菌丝白色不规则,长势差 |
Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. Different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level. | |
注：不同小写字母表示0.05水平上的差异显著,不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著。 |
3 讨论
假芝（A. rugosum）属于灵芝科（Ganoder- mataceae）假芝属（Amauroderma）,主要分布于热带及亚热带地区,我国华南及西南地区。人们对假芝属真菌的研究历史悠久,除了药用价值外,对引起林木病害的研究报道较少。其中大多数生长在倒木和腐朽木上,是腐生菌,但也有一些种类寄生在活立木上,如二孢假芝[Amauroderma subresinosum (Murrill) Corner]等是林木的病原菌。戴玉成等人报道海南五指山市等地台湾相思树死亡的病原菌中有粗柄假芝（Amauroderma elmerianum Murrill.）[9]。本文作者在海南省定安市南丽湖南海农场等地发现的台湾相思根腐病病树上的假芝属担子菌经形态学特征比较并结合分子生物学鉴定分析,确定该病菌为假芝[Amauroderma rugosum (Bl.et Nees) Torrend],两者担子果形态上较相似,但假芝的管口近圆形或不规则形,担孢子近球形,而粗柄假芝的管口近圆形,担孢子广椭圆形[14]。该病原菌在三种光照条件下没有明显差别,黑暗对其生长存在抑制作用;适宜生长温度范围为25~35 ℃,最适生长温度为32 ℃;最适pH为5;在测定的几种碳源中,以D-果糖为碳源的菌落长势最好;在氮源方面,单一氮源以硝酸钙为氮源的菌落长势最好。在复合氮源中,酵母浸膏为氮源长势最好。肖自添等[17]在广州市白云山得到的一株假芝最适碳源是果糖与作者研究基本一致;最适pH生长范围是7.0~8.0,比笔者研究的pH 5偏碱;最适生长温度范围是30 ℃,与笔者研究基本一致。