科学的氮素施肥能提高苗木产量和质量,而合理的氮素施肥不仅能够提高苗木质量和养分利用效率,还能够增强苗木生存竞争力和节省肥料。因此,科学的氮素施肥一直是植物养分管理的研究热点之一[1,2,3]。近年来许多学者对美国红松（Pinus resinosa）[4]、蓝按（Eucalyptus globulus）[5]、异叶铁杉（Tsuga heterophylla）[6]、黑云杉（Picea mariana）[7]、咖啡[8]等树种开展了等量施肥、指数施肥和修正指数施肥等研究,发现不同林木对施肥方法和施肥量的响应不同;因此,根据不同树种的生物学特性,探讨不同施肥方式对林木生长的影响效应,进而筛选出适宜的养分管理方法,对于促进林木生长和提高养分利用效率至关重要[9,10]。
米老排（Mytilaria laosensis L.）别名壳菜果、马蹄荷、山油桐等,为金缕梅科（Hamamelidaceae）壳菜果属常绿阔叶树种,天然分布于广东西部、广西西南部和云南东南部[11],是我国南方发展人工林的重要乡土阔叶树种[12]。近年来,随着米老排不断在速生丰产林和生态公益林建设的推广应用,加强苗木质量管理和培育优质苗木显得尤为重要[13];为此,许多学者从米老排苗期养分管理为切入点,分析了不同施肥方式对苗木生长和养分吸收的影响效应[14,15,16]。目前的苗期施肥研究主要是侧重于从生长和养分方面进行分析,而对光合生理的响应鲜有涉及;相关研究表明,基于苗木光合作用和生理状况确定其生存潜力和活力,对预测苗木质量和造林效果有重要的指示意义[17,18]。因此,为进一步优化施肥模式和深入探究苗期施肥效应,本研究采用3种施肥方法（等量施肥、阶段递增施肥和修正指数施肥法）、5个供氮水平（50、100、200、400、600 mg/株）,通过测量光合气体交换和生理参数,分析研究不同施氮方式对其产生的影响,以期从光合生理特性角度指导米老排苗木的合理养分管理。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为我国广西靖西（106°48°E,23°48° N）同一优良米老排母株上采集种子而培育实生苗,翌年5-11月在中国林业科学研究院热带林业研究所（113°17°E,23°8°N）温室中开展施肥试验。
供试肥料为普罗丹高浓度水溶性复合肥（Planta fertilizer,N:P:K=20:20:20,Plant Products Co. Ltd., Brampton, Ont.）,以去除潜在的由施肥、灌溉条件对苗木生长和生理产生的交互影响（Salifu,2003）,其主要养分含量为N 20%,P2O5 20%,K2O 20%,螯合铁（Fe）0.10%,螯合锰（Mn）0.05%,螯合锌（Zn）0.05%,螯合铜（Cu）0.05%,硼（B）0.02%,钼（Mo）0.0005%,EDTA螯合体1.00%。
1.2 方法
1.2.1 试验设计与措施 选取长势良好、大小均匀一致、苗高约10 cm的播种苗于2013年5月进行移苗。移苗前,根据由基质确定的最大持水量的75%作为移苗时的初始水量[4];此后每周浇水,确保所有苗木水分条件一致。移苗时,先用自来水冲洗几次,再用去离子水将幼苗冲洗干净,然后将其移栽到育苗容器中（规格为10 cm× 8 cm×10 cm塑料盆,盆内套有双层白色塑料袋,以尽量避免水肥流失）;培养基质为高压灭菌处理的混合基质（泥炭:蛭石:珍珠岩=3:2:2,体积比）,理化性质主要为pH 6.43,有机质39.56 g/kg,全氮4.05 g/kg,全磷0.43 g/kg,全钾17.04 g/kg,碱解氮330.69 mg/kg,有效磷41.41 mg/kg,速效钾102.97 mg/kg。
采用随机区组设计,设置3种施肥方式,即等量施肥（C）、阶段递增施肥（A）和修正指数施肥（ME）,每种施肥方式设定50、100、200、400、600 mg/株共5个施氮量水平,以不施肥为对照（CK）,总共16个处理水平,4次重复,每个小区24株,共计1536株。
稳定2周后,即移苗后第3周,开始施肥,每周施肥1次,共16次,具体施肥方案见表1。为减少边际效应,定期移动苗盘。整个试验期间,温室未使用人工光源,白天平均温度为23~38 ℃,平均湿度为34%~78%,平均光照强度为6300~7800 lx。
表1 米老排苗期氮素施肥方案Tab. 1 Nitrogen application for M. laosensis seedlings |
| 处理 Treatment | 施氮素量Nitrogen fertilization/(mg·株-1) | |||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 3周 | 4周 | 5周 | 6周 | 7周 | 8周 | 9周 | 10周 | 11周 | 12周 | 13周 | 14周 | 15周 | 16周 | 17周 | 18周 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 50C | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 | 3.13 |
| 100C | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 | 6.25 |
| 200C | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 | 12.50 |
| 400C | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 |
| 600C | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 | 37.50 |
| 50A | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 3.75 | 3.75 | 3.75 | 3.75 | 3.75 | 5.00 | 5.00 | 5.00 |
| 100A | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 7.50 | 7.50 | 7.50 | 7.50 | 7.50 | 10.00 | 10.00 | 10.00 |
| 200A | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 10.00 | 10.00 | 10.00 | 10.00 | 10.00 | 15.00 | 15.00 | 15.00 | 15.00 | 15.00 | 20.00 | 20.00 | 20.00 |
| 400A | 10.00 | 10.00 | 10.00 | 20.00 | 20.00 | 20.00 | 20.00 | 20.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 40.00 | 40.00 | 40.00 |
| 600A | 15.00 | 15.00 | 15.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 30.00 | 45.00 | 45.00 | 45.00 | 45.00 | 45.00 | 60.00 | 60.00 | 60.00 |
| 50ME | 1.14 | 1.26 | 1.41 | 1.57 | 1.77 | 1.99 | 2.24 | 2.53 | 2.86 | 3.24 | 3.67 | 4.16 | 4.71 | 5.34 | 6.06 | 6.06 |
| 100ME | 1.78 | 1.96 | 2.00 | 2.50 | 2.87 | 3.31 | 3.85 | 4.49 | 5.26 | 6.17 | 7.25 | 8.53 | 10.05 | 11.85 | 13.97 | 13.96 |
| 200ME | 3.15 | 3.29 | 3.56 | 4.00 | 4.60 | 5.40 | 6.43 | 7.74 | 9.38 | 11.43 | 13.97 | 17.10 | 20.97 | 25.75 | 31.62 | 31.61 |
| 400ME | 6.59 | 6.22 | 6.23 | 6.63 | 7.45 | 8.73 | 10.55 | 13.03 | 16.32 | 20.64 | 26.23 | 33.47 | 42.79 | 54.78 | 70.19 | 70.16 |
| 600ME | 10.86 | 9.58 | 9.03 | 9.16 | 9.98 | 11.55 | 14.00 | 17.51 | 22.23 | 28.85 | 37.55 | 49.08 | 64.32 | 84.42 | 110.9 | 110.9 |
其中等量施肥公式为：
${{N}_{t}}=\frac{{{N}_{\text{T}}}}{t}$
式中,NT为设置的氮素施用量,t为施肥次数。
阶段递增施肥公式为：
${{N}_{1}}=\frac{2{{N}_{\text{T}}}}{\left( S+1 \right)t}$
${{N}_{S}}={{N}_{1}}S$
式中,N1是第1阶段施肥量,NS是第S阶段施肥量,NT为设置的氮素施用量,t为施肥次数,S为施肥阶段数。
修正指数施肥采用Birge等[19]描述的方法确定施肥量,具体如下：
${{N}_{\text{T}}}={{N}_{S}}\left( {{\text{e}}^{rt}}-1 \right)$
式中,r是从苗木在施肥处理前最初阶段的养分含量NS增加至最终氮含量（NT+NS）的相对增加率,NT为设置的氮素施用量,t为施肥次数。
${{N}_{t}}={{N}_{S}}\left( {{\text{e}}^{rt}}-1 \right)-{{N}_{t-1}}$
式中,Nt是第t次施肥量,Nt-1是包括第(t-1)次施肥的施氮的累积量。
修正施肥即氮补偿,是通过增加初始氮添加和减少生长末期施用量来实现的,公式如下：
${{N}_{\text{C}}}={{N}_{0}}\left( {{\text{e}}^{rt}}-1 \right)$
式中,NC（氮补偿）是由公式(2)得出的最后2次施氮量的差值,并按上述公式补偿到根系中。N0是补偿期间最后的氮素添加量。
1.3 取样调查与指标测定
光合指标测定：施肥结束待幼苗稳定15 d后,用Li-6400便携式光合测定仪（LI-COR, Lincoln, USA）活体测定米老排幼苗的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和胞间CO2浓度（Ci）,选择晴朗无风天气,于上午9：30~12：00和下午2：00~4：30进行。每个处理选取3株测定,每株从顶端起第2或3片功能叶开始连续测定3片健康的植物叶片,重复3次。测定时,使用开放式气路,红蓝光源,设定饱和光强1200 μmol/(m2·s),叶室温度(30±0.5)℃,相对湿度约60%,大气CO2浓度约400 μmol/mol,空气流速500 μmol/s。
1.4 数据处理
采用Excel 2007软件和SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析并绘制图表。方差分析用于检验不同施肥方法对各光合和生理指标产生的影响,当P<0.05时,用Duncan法进行多重比较。由于试验结束时600C、600A、600ME处理苗叶片枯萎脱落、茎褐化萎缩,说明这些处理不利于米老排幼苗培育,因此不参与数据分析。
2 结果与分析
2.1 供氮方式对米老排光合气体交换参数的影响
由图1可知,所有施肥处理均提高了净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,但降低了胞间CO2浓度。随着氮素施用量的增加,不同施肥方式下的米老排叶片前3个光合气体交换参数均呈现出先增后减的趋势,且均分别在200 mg/株（C）、100 mg/株（A）和100 mg/株（ME）处出现峰值,其苗木Pn、Gs、Tr值依次分别是对照的5.76、6.33、5.46倍（C）,4.27、4.26、4.15倍（A）和4.43、3.58、4.06倍（ME）,均与对照形成显著差异;而胞间CO2浓度随施氮量的增加总体上呈下降趋势。米老排的光合作用对不同供氮方式均产生了不同的响应,有效改善米老排叶片光合气体交换作用的最佳施肥处理是200C。除此之外,在施氮量达到400 mg/株时所有处理中的Pn、Gs、Tr和Ci值都呈现出显著下降的趋势,说明氮素达到400 mg/株时已经过量,对幼苗的生长造成了胁迫,导致其光合气体交换值降低。
2.2 供氮方式对叶片光合色素的影响
光合色素含量的多少反映植物光合作用的强弱。由表2可知,传统施肥时,不同处理苗木叶片Chla、Chlb、ChlT、Car含量和Chla/b值均随着供氮水平的增加表现出先升后降的趋势,且均在200 mg/株时达到峰值：16.55、5.25、21.8、7.21 μg/cm2和3.24,分别比对照提高了52.9%、40.4%、18.2%和18.0%;ChlT/Car则呈现相反趋势,并在200 mg/株时为最低值3.08,是对照的92.3%。阶段递增方式施肥时,与对照相比,不论何种供氮水平,不同处理苗木叶片的Chla、ChlT、Car含量和Chla/b值均有不同程度的增加;低剂量供氮（50 mg/株）时,米老排叶片Chlb含量下降,中高剂量施肥提高了其Chlb含量;除200 mg/株时叶片ChlT/Car高于对照,其他剂量氮素施肥米老排ChlT/Car均降低,但均未达到显著差异。修正指数施肥方式下,随着施氮水平的增加,苗期米老排叶片Chlb含量有先降后升的趋势、ChlT/Car值则相反,其他光合色素参数均逐渐增加;除ChlT/Car外,高剂量氮素400 mg/株处理米老排叶片的光合色素指标均与对照差异显著。
表2 供氮方式对米老排叶片光合色素的影响Tab. 2 Effects of nitrogen applying regimes on photosynthetic pigment of M. laosensis seedlings |
| 处理 Tteatment | 叶绿素a含量 Chla content | 叶绿素b含量 Chlb content | 叶绿素总量 ChlT content | 类胡萝卜素含量 Car content | 叶绿素a/b Chla/b | 叶绿素/类胡萝卜素值 ChlT/Car Value |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 10.83±1.60f | 4.70±0.68cd | 15.53±2.16g | 4.65±0.53g | 2.31±0.24c | 3.34±0.19abc |
| 50C | 12.29±1.95ef | 4.14±0.84d | 16.42±2.75fg | 5.00±0.71bcd | 3.00±0.25ab | 3.28±0.21abc |
| 100C | 15.81±2.27bc | 5.07±0.93abc | 20.88±3.11bcd | 6.42±1.01cde | 3.15±0.32ab | 3.27±0.26abc |
| 200C | 16.44±1.75ab | 5.25±1.04abc | 21.8±2.44abc | 7.21±1.31ab | 3.24±0.58a | 3.08±0.43c |
| 400C | 14.95±2.21bc | 4.82±0.74bcd | 19.76±2.79def | 6.48±1.69abcd | 3.12±0.36ab | 3.16±0.53bc |
| 50A | 14.16±2.27cd | 4.56±0.70cd | 18.72±2.79def | 5.73±1.00abc | 3.12±0.37ab | 3.28±0.18abc |
| 100A | 14.99±1.69bc | 4.91±0.67bcd | 19.90±2.26bcde | 6.07±0.74bcde | 3.07±0.24ab | 3.29±0.26abc |
| 200A | 14.58±2.05cd | 5.05±1.13abc | 19.62±3.09cde | 5.80±0.91bcde | 2.95±0.36ab | 3.40±0.33ab |
| 400A | 15.97±2.00abc | 5.23±1.20abc | 21.2±2.98abcd | 6.92±1.03bcd | 3.14±0.45ab | 3.09±0.45bc |
| 50ME | 12.91±1.70de | 4.52±0.83cd | 17.42±2.48efg | 4.99±0.58fg | 2.89±0.26b | 3.49±0.22a |
| 100ME | 15.36±1.29bc | 5.22±0.63abc | 20.59±1.83bcd | 5.92±0.49def | 2.96±0.21ab | 3.48±0.19a |
| 200ME | 16.59±2.98ab | 5.70±1.65ab | 22.28±4.54ab | 6.69±1.34efg | 2.99±0.36ab | 3.34±0.36abc |
| 400ME | 17.67±1.76a | 5.91±0.58a | 23.57±2.05a | 7.50±1.41a | 3.01±0.32ab | 3.21±0.40abc |
Note：The data is the mean value of four replicates±standard deviation, the different lowercase letters in same column indicate significant difference among different treatments (P<0.05). | |
注：数据为平均值±标准差,同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 |
2.3 供氮方式对叶片丙二醛含量的影响
2.4 供氮方式对叶片脯氨酸含量的影响
由图3可知,不同施氮处理间米老排叶片脯氨酸（Pro）含量达到显著差异（P<0.05）,说明施肥方式及施肥量,对米老排叶片Pro含量产生很大影响;进一步分析发现,无论何种施肥方式,均在供氮量达到400 mg/株时,叶片Pro含量呈现出显著性升高的趋势;同时其他处理与对照相比没发生显著性变化。这些说明当供氮量达到400 mg/株时,米老排幼苗受到了明显的胁迫,施肥过量对苗木造成一定的伤害。
2.5 供氮方式对米老排叶片超氧化物歧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于自然界动植物以及一些微生物体内,可减少脂质过氧化和稳定膜透性[24]。方差分析结果表明：3种施肥方式下米老排叶片SOD活性均随着供氮水平的提高而降低,与施氮量呈现负相关（图4）。同等施氮量下,100、200、400 mg/株时采用传统方式施肥米老排叶片的SOD活性最高,50、200 mg/株时采用阶段递增施肥方式米老排叶片的SOD活性分别为最高和最低,50、100、400 mg/株时采用修正方式施肥的米老排叶片SOD活性为最低。多重比较发现：所有施肥处理与对照差异显著,说明氮肥施用均显著降低了苗期米老排叶片SOD活性;同等施氮量下,各个供氮水平在施肥方式间均未见显著差异。
3 讨论
叶片中光合色素含量是反映植物光合能力的一个重要参数,环境因子的改变会引起光合色素含量的变化,进而引起光合性能的改变。本研究中发现,适当施氮可使米老排叶片的Chla、ChlT和Car含量随之增加,但当施肥量达到一定值时,光合色素含量随施肥量增加而降低,可能是肥料浓度超过该植物耐受范围,对其产生了胁迫作用[30];刘福妹等[31]采用等量施肥方法分析了不同施肥量对米老排苗木的叶绿素荧光参数的影响,发现200 mg/株的施氮量最有利于提高苗木的光合效率,而本研究也证实了等量施氮肥200 mg/株的方式能有效促进苗木的光合作用。低氮供应时米老排Chlb均降低,以减少对光的吸收、免受光胁迫伤害[32]。ChlT/Car值的高低与植物忍受逆境的能力密切相关[33],其值低于对照说明幼苗的光保护能力得到提高,但幼苗对光的吸收能力有所下降[34]。
处于逆境中的植物,其生理生化特性常常会发生许多变化以维持植物体内的代谢平衡,保护自身结构,从而缓解逆境对植物造成的伤害[35]。本研究发现,与不施肥相比,所有施肥处理均能有效降低米老排叶片MDA含量,表明氮素施肥能显著提高幼苗对逆境的抗性;但随供氮水平的提高,MDA含量均呈现先降低后升高的趋势,这可能与氮素过量对植物造成胁迫而体内活性氧含量增多,最终导致细胞膜脂过氧化加剧和MDA积累增加有关[26]。无论何种施肥方法,叶片Pro含量均在400 mg/株时与其他处理存在显著差异,说明高浓度的氮素已经对米老排幼苗造成从胁迫[15]。3种施肥方法下米老排叶片SOD活性均随着供氮水平的提高而降低,表明低氮条件下,较高的SOD活性将提高植物体适应能力,忍受逆境而得以生存;随着氮素营养条件的改善,幼苗快速生长,体内活性氧的产生减少、自由基含量降低,抗氧化酶系统尚未得到充分激发,故而叶片中活性氧清除剂SOD总体水平较低。
不同施肥方法对植物生长和生理特性具有不同的影响[36],如米老排的最佳施肥方法为等量施肥[14],马来沉香、土沉香、尾巨桉和欧洲云杉等为指数施肥或修正指数施肥[8, 36-37];另一方面,施肥量显著影响苗木生长和光合作用[2, 9],且往往与施肥方法和不同植物产生较强的互作[6,7]。对于米老排而言,现有的施肥研究表明,等量施氮肥200 mg/株最有利于提高苗木质量指数和促进苗木生长[15, 29];而本研究证实了这种施肥方式总体上最能改善苗木光合气体交换作用、增强光合作用和提高忍受逆境的能力,表明了光合生理特性与苗木生长具有较强的一致性[18],其结果为苗期养分的精细化管理和培育高质量的苗木提供参考依据。
4 结论
不同供氮方式和施肥量对米老排苗木的光合生理特性产生不同的影响。适量氮素供给可以显著改善米老排叶片光合气体交换性能,氮素施用不足或过量均对苗木产生不利影响;施肥处理均能有效降低米老排叶片丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性,可显著提高幼苗对逆境的抗性;低剂量施氮肥能够降低叶片中游离脯氨酸含量,有利于提高植物体适应能力。综上所述,等量施肥200 mg/株的供氮方式最有利于改善米老排苗木的光合生理特性。