香草兰（Vanilla planifolia Andrews）又名香荚兰,原产于墨西哥,典型的热带兰科作物,被誉为“食品香料之王”[1]。它是食品、饮料和化妆品中最重要和最受欢迎的芳香化合物之一[2,3]。新鲜的香草兰豆荚并没有香气,而经过发酵的豆荚中却存在极其丰富的风味物质。至今已分离到220种以上的挥发性风味物质,主要成分为醛类、酯类、醚类及酮类物质,其中价值最高的是香兰素（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）[4,5]。香草兰发酵产生的香兰素作为一种重要香料资源,具有化工合成的香料无法比拟的效果,因此世界上对其需求越来越大[6,7]。香草兰传统的加工过程通常包括4个步骤,即杀青（Blanched）、发汗（Sweated）、干燥（Dried）和陈化（Conditioned）[8,9,10]。杀青是通过加热或冷冻的方法,破坏细胞组织结构,使新鲜豆荚停止呼吸作用。发汗是对杀青后的豆荚进行快速脱水干燥,避免后续发酵过程中霉菌的生长。干燥是通过太阳晾晒或干燥炉烘烤进一步降低豆荚的含水量,抑制霉菌生长。陈化是将干燥好的豆荚置于密闭箱,贮藏半年以上,在此期间豆荚会经历一系列的酯化、醚化、氧化等反应,形成香草兰特有的香味[8,9,10,11]。
目前关于海南气候条件下香草兰加工过程中主要成分的动态变化和生成途径尚不清楚,关于加工过程对香草兰代谢物变化影响的报道也很少,因此本研究拟以海南地区种植采收的香草兰豆荚为实验材料,对鲜豆荚（fresh vanilla beans,FVB）、杀青豆荚（blanched vanilla beans,BVB）、发汗豆荚（sweated vanilla beans,SVB）、干燥豆荚（dried vanilla beans,DVB）和陈化豆荚（conditioned vanilla beans,CVB）采用LC-MS/MS的方法和多元统计的方法分析发酵过程中豆荚小分子物质的代谢规律,识别差异代谢物,为推断风味成分特别是香兰素的生成途径和发酵过程风味物质的调控提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 香草兰豆荚由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供,鲜豆荚于2017年11月采收。甲醇、乙醇、乙腈购自Merck公司,均为色谱纯。
1.1.2 仪器与设备 研磨仪（MM 400,德国Retsch）,超高效液相色谱（UPLC,Shim-pack UFLC Shimadzu CBM30A,日本岛津）,串联质谱（MS/MS,Applied Biosystems 6500 QTRAP,美国Applied Biosystems）。
1.2 方法
1.2.1 样品制备和提取 （1）样品的制备。首先将鲜豆荚（FVB）置于(70±3) ℃水浴中杀青3~5 min,然后将杀青豆荚（BVB）取出滤干盖上毛巾,在(50±5) ℃温度下,每天发汗5 h,重复5 d。接着把发汗豆荚（SVB）移至干燥房,置于晾干架上晾干,及时收取含水量约30%~40%的豆荚进行陈化,最后将干燥豆荚（DVB）真空包装,荫蔽环境下陈化6个月,可得陈化豆荚（CVB）。
（2）样品的提取。首先取真空冷冻干燥的不同加工阶段的香草兰豆荚利用研磨仪研磨（30 Hz,1.5 min）至粉末状;然后分别称取100 mg的粉末,在1.0 mL的甲醇水溶液中进行溶解;溶解后的样品在4 ℃冰箱过夜,为了提高提取率,期间要进行3次涡旋;最后将样品以12 000 r/min的转速,离心10 min,吸取上清,用0.22 μm的微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中,用于LC-MS/MS分析。
1.2.2 色谱质谱采集条件 （1）液相条件主要包括：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 （1.8 µm,2.1 mm×100 mm）;流动相：水相为超纯水（加入0.04%的乙酸）,有机相为乙腈（加入0.04%的乙酸）;洗脱梯度：0~11min水/乙腈（95∶5, V/V）,11.0~12.00 min为5∶95 （V/V）, 12.00~12.1 min为95∶5 （V/V）,12.1~15.0 min为95∶5（V/V）;流速0.4 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL。
（2）质谱条件主要包括：电喷雾离子源（electrospray ionization,ESI）温度500 ℃,质谱电压5500 V,帘气（curtain gas,CUR）25 psi,碰撞诱导电离（collision-activated dissociation,CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中,每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential,DP）和碰撞能 （collision energy,CE）进行扫描检测[12]。
1.2.3 代谢物定性与定量 基于自建数据库MWDB（metware database）及MassBank,KNAPSAcK,HMDB,MoTo DB,METLIN和其他已经存在的代谢物信息公共数据库,根据二级谱信息进行物质定性,分析时去除了同位素信号,含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号,以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。
代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring,MRM）分析完成。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后,对所有物质质谱峰进行峰面积积分,并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[13]。
2 结果与分析
2.1 数据的评估
2.1.1 聚类分析 如图1所示,由热图对样本的分层聚类可以看出FVB与BVB的组间差异比较小,而SVB、DVB、CVB这3者之间的组间差异比较小,并且SVB与DVB的差异更小,CVB和这两者的组间差异则大一些,这也反映了豆荚在陈化过程有很多物质都发生了很大的变化。这一点在颜色上也有体现,FVB和BVB都是呈现绿色,然而SVB、DVB、CVB的颜色则呈现褐色,并且随着发酵的进行,颜色逐渐加深。而对代谢物的聚类分析表明FVB和BVB 2个阶段的豆荚的代谢物含量较SVB、DVB、CVB 3个阶段的豆荚代谢物含量更高。聚类热图也反映出,FVB和BVB 2个阶段的豆荚的代谢物含量变化具有一致性,SVB、DVB、CVB 3个阶段的豆荚代谢物含量变化有一定的差异性。
图2 样品间相关性图Fig. 2 Repetitive correlation between samples of different groups (FVB, BVB, SVB, DVB, and CVB) and the quality control sample (mix: mixture of extractive of samples). |
表1 香草兰不同加工阶段样品的相关性Tab. 1 Repetitive correlation between samples of different groups |
| 组别 Group | 平均皮尔逊相关系数 Average Pearson correlation coefficient | 组别 Group | 平均皮尔逊相关系数 Average Pearson correlation coefficient | 组别 Group | 平均皮尔逊相关系数 Average Pearson correlation coefficient |
|---|---|---|---|---|---|
| FVB和FVB | 0.961 | FVB和BVB | 0.920 | BVB和DVB | 0.606 |
| BVB和BVB | 0.992 | FVB和SVB | 0.569 | BVB和CVB | 0.736 |
| SVB和SVB | 0.987 | FVB和DVB | 0.585 | SVB和DVB | 0.856 |
| DVB和DVB | 0.904 | FVB和CVB | 0.659 | SVB和CVB | 0.745 |
| CVB和CVB | 0.950 | BVB和SVB | 0.692 | DVB和CVB | 0.673 |
2.2 数据结果分析
2.2.1 差异倍数（Fold Change）分析 各分组差异倍数变化前20的代谢物如图3所示,由图可知,和鲜豆荚相比,BVB、SVB、DVB、CVB上调的代谢物主要是黄酮类物质,以糖苷类物质为主,上调倍数最大的是芹菜素 5-O-葡萄糖苷。此外,金圣草黄素 5-O-己糖苷、金合欢素 O-乙酰己糖苷和圣草酚 C-己糖的上调也非常突出。糖苷类物质的上调为酶提供了丰富的底物,有助于香草兰风味的形成。一些研究认为香草醛大部分是以葡糖基的形式存在的,以游离形式存在的比较少[14],还有一些研究认为香草醛仅以其葡糖基形式积累[15,16]。Odoux等[7]研究表明除了香草醛,许多芳香族化合物如香草酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸等,也都是以葡萄糖苷形式存在于绿色香草兰豆荚中。然而,和其他组相比,FVB和CVB之间有机酸及其衍生物有着明显的上调。这与董智哲等[17]采用SPME-GC-MS的方法,在中国海南、汤加、科摩罗的陈化豆荚中分别检测到酸类物质的结果一致。洪英华[18]的研究也表明豆荚在整个加工过程中显酸性,并且随着加工过程的进行,豆荚的pH先上升后下降,陈化后的豆荚pH降低至4.42,比新鲜豆荚降低了1个pH单位。而下调的代谢物种类比较丰富,以核苷酸及其衍生物为主,此外还有苯甲酸衍生物、维生素类、黄酮碳糖苷、氨基酸衍生物等。可能是由于具有相对完整植物生理功能的鲜豆荚,经过一系列加工处理后,细胞和组织结构受到破坏,生理功能受到严重扰动,很多代谢物会出现下调。和鲜豆荚相比,CVB比DVB有更多黄酮糖苷类代谢物下调,表明糖苷类物质在转化为香草兰特有风味的过程中是动态变化的,既有生成,又有消耗。
2.2.2 正交偏最小二乘法（OPLS-DA）判别分析 偏最小二乘判别分析（partial least squares- discriminant analysis, PLS-DA）是一种有监督模式识别的多元统计分析方法,可以使组间区分最大化,有利于寻找差异代谢物。如云琦等[19]研究表明采用HPLC-UV指纹图谱结合 PLS-DA可用于新疆桃仁的质量控制及分类。田洪磊[20]研究表明小白杏杏仁油指纹信息与PLS-DA判别分析相结合的方法可实现小白杏杏仁油和其他油脂的有效检测及准确判别。杨忠等[21]的研究表明,与SIMCA法相比,PLS-DA法对木材生物腐朽样本的判别准确率更高。Palama 等[22]通过PCA和PLS-DA分析表明不同生长时期的香草兰豆荚（授粉后3~8个月）的代谢物呈现分离趋势。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和PLS-DA方法,实验结果更加可靠。
本研究建立了FVB和BVB、FVB和SVB、FVB和DVB、FVB和CVB、BVB和SVB、BVB和DVB,BVB和CVB,SVB和DVB、SVB和CVB、DVB和CVB 10组OPLS-DA模型。在这10组模型中,其中R2Y均为1,Q2Y都大于0.97（表2）,说明这10组模型构建非常好,里面的每1个点可以充分代表原始数据,并且拥有良好的预测能力,能很好地解释2组样本之间的差异。
表2 OPLS-DA分析的参数Tab. 2 The parameters of OPLS-DA analysis |
| 组别Group | R2Y | Q2Y | 组别Group | R2Y | Q2Y |
|---|---|---|---|---|---|
| FVB和BVB | 1 | 0.971 | BVB和DVB | 1 | 0.999 |
| FVB和SVB | 1 | 0.998 | BVB和CVB | 1 | 0.998 |
| FVB和DVB | 1 | 0.999 | SVB和DVB | 1 | 0.989 |
| FVB和CVB | 1 | 0.999 | SVB和CVB | 1 | 0.997 |
| BVB和SVB | 1 | 0.998 | DVB和CVB | 1 | 0.975 |
图4 香草兰不同加工阶段之间的OPLS-DA得分图FB：FVB与BVB; FS：FVB与 SVB; FD：FVB与DVB;FC：FVB与CVB; BS：BVB与SVB; BD：BVB与DVB;BC：BVB与CVB; SD：SVB与 DVB; SC：SVB与 CVB; DC：DVB与CVB。 Fig. 4 The OPLS-DA score plots of between samples of different groups FB: FVB and BVB; FS: FVB and SVB; FD: FVB and DVB; FC:FVB and CVB; BS: BVB and SVB; BD: BVB and DVB; BC: BVB and CVB; SD: SVB and DVB; SC: SVB and CVB; DC: DVB and CVB. |
2.3 差异代谢物筛选
2.3.1 差异代谢物火山图 差异代谢物以fold change≥2和fold change≤0.5以及VIP≥1的作为筛选标准。由表3和图5可知,FVB和BVB,FVB和SVB,FVB和DVB,FVB和CVB,BVB 和SVB,BVB和DVB,BVB和CVB,SVB和DVB,SVB和CVB,DVB和CVB 差异表达显著的代谢物总数分别为124、204、229、232、200、226、235、214、256、213。其中SVB与CVB的差异表达的显著的代谢物总数是最多的。可能是因为发汗是在高温（45~65 ℃）高湿（60%~70%）的条件下持续了7~10 d。在此期间开始发生酶促反应如水解、氧化,也会发生非酶促氧化反应,同时较高的温度会加速反应的发生[23,24],而陈化豆荚的水分含量只有25%~30%,有些挥发物会损失,同时也发生了一些酶促反应、非酶反应和微生物反应,变更了香草兰的风味[8]。Frenkel等[8]研究表明陈化也与脂质氧化有关。可以看出这2个阶段的豆荚都经历了复杂的反应,可能差异代谢物比较多。和FVB相比,CVB差异表达显著的代谢物总数是最多的,主要是因为陈化为发酵的最后一步,前期处理的半成品豆荚经过装袋密封或置于密闭箱,贮藏半年以上,这期间豆荚会发生多种化学反应和生化反应,如酯化、醚化、氧化等反应,代谢物会有显著的改变[11]。然而和FVB相比, SVB的上调差异表达显著的代谢物是最多的,有102种,可能是因为这个阶段提高了处理温度,酶活性被激发,促进了前体物的水解[23,24]。只有FVB与KVB的上调是高于下调差异显著代谢物的数量。可能与鲜豆荚经过杀青之后细胞和组织结构受到破坏,豆荚的生命活力停止,各种前体物溶出有关[8]。
表3 各差异分组差异显著代谢物统计（FVB,BVB,SVB,DVB和CVB）Tab. 3 Differentially significant metabolite statistics between samples of different groups (FVB, BVB, SVB, DVB, and CVB) |
| 组别 Group | 总的差异显著代谢物 Total metabolites of significant differences | 下调差异显 著代谢物 Metabolites of down-regulated significant differences | 上调差异显 著代谢物 Metabolites of up-regulated significant differences |
|---|---|---|---|
| FVB和BVB | 124 | 54 | 70 |
| FVB和SVB | 204 | 102 | 102 |
| FVB和DVB | 229 | 135 | 94 |
| FVB和CVB | 232 | 154 | 78 |
| BVB和SVB | 200 | 104 | 96 |
| BVB和DVB | 226 | 140 | 86 |
| BVB和CVB | 235 | 153 | 82 |
| SVB和DVB | 214 | 150 | 64 |
| SVB和CVB | 256 | 173 | 83 |
| DVB和CVB | 213 | 122 | 91 |
图5 差异代谢物火山图FB：FVB与BVB;FS：FVB与 SVB; FD：FVB与DVB;FC：FVB与CVB; BS：BVB与SVB;BD：BVB与DVB; BC：BVB与CVB; SD：SVB与 DVB;SC：SVB与 CVB;DC：DVB与CVB;图中绿色的点代表下调差异表达代谢物,红色的点代表上调差异表达代谢物,黑色代表检测到但差异不显著的代谢物。 Fig. 5 Volcano plot of differential metabolites FB: FVB and BVB; FS: FVB and SVB; FD: FVB and DVB; FC: FVB and CVB; BS: BVB and SVB; BD: BVB and DVB; BC: BVB and CVB; SD: SVB and DVB; SC: SVB and CVB; DC: DVB and CVB; the green dots represent down-regulated significant differences in metabolites, the red dots represent up-regulated significant differences in metabolites, and black dots represent metabolites detected but not significantly different. |
2.3.2 差异代谢物聚类分析 差异代谢物分层聚类分析结果如图6所示,和鲜豆荚相比,差异显著代谢物主要是黄酮类化合物、有机酸及其衍生物、脂质及其衍生物、氨基酸及其衍生物。
与FVB相比,BVB、SVB、DVB中上调差异显著的黄酮类化合物随着加工的进行逐渐增多,分别为11、21、23种,在陈化阶段有所下降,只有17种,可能由于陈化处理历时半年以上,在此期间豆荚发生了多种化学反应和生化反应,如酯化、醚化、氧化等反应,有很多黄酮类化合物都参与了反应,导致陈化阶段上调差异显著的黄酮类化合物有所下降,而下调差异显著的黄酮类化合物数量在陈化阶段也是最多的,也说明了这一点[11]。下调差异显著的黄酮类化合物数量随着加工的进行也逐渐增多,陈化阶段达到58种。上调差异显著的黄酮类化合物包含黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷、黄烷酮,而下调差异显著的黄酮类化合物还包含黄酮-木脂素,可能与鲜豆荚经过杀青之后细胞和组织结构受到破坏,各种前体物溶出有关,并且随着加工的进行豆荚会发生一系列的酶促反应和非酶氧化,使得黄酮-木脂素下调明显。其中BVB下调差异显著的黄酮类化合物则不含有黄酮-木脂素和黄酮碳糖苷,可能与杀青阶段一系列的酶促反应和非酶氧化还未充分进行有关。
与FVB相比,BVB、SVB、DVB、CVB上调差异显著的有机酸及其衍生物分别为4、16、16、14种,BVB、SVB、DVB、CVB上调幅度最大的有机酸及其衍生物分别为2-异丙基苹果酸、2-羟基丁酸、3-(3-羟基苯基)丙酸、3-(3-羟基苯基)丙酸、而下调的差异显著有机酸及其衍生物为精氨琥珀酸盐。
与FVB相比,上调差异显著的氨基酸及其衍生物在SVB阶段最高,达到12种,DVB、CVB阶段呈下降趋势,分别为7种和3种,BVB、SVB、DVB上调差异显著的氨基酸及其衍生物主要是N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸,L-亮氨酸、天门冬氨酸二葡糖苷。CVB中没有氨基酸的显著上调。下调差异显著的氨基酸及其衍生物数量随着加工的进行逐渐增多,陈化阶段多达16种,下调差异显著的氨基酸主要是酪胺、L-色氨酸、L-组氨酸,其中CVB阶段下调的氨基酸种类最多,除了酪胺、L-色氨酸、L-组氨酸,还包含L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-瓜氨酸、L-(+)-精氨酸、L-蛋氨酸、L-(-)-酪氨酸,下调的氨基酸及其衍生物可能主要参与非酶氧化。
3 讨论
通过fold change以及VIP来筛选差异显著代谢物,可知SVB与CVB的差异表达显著的代谢物总数是最多的,可能是因为发汗是在高温（45~65 ℃）高湿（60%~70%）的条件下进行的,而陈化是在低水分常温的条件下进行的,不同的反应条件,酶促反应和非酶反应进行的程度以及方式都可能造成代谢物的显著差异[8]。FVB与SVB上调差异表达显著的代谢物是最多的,有102种,可能是因为发汗时适当提高了处理温度,酶活性被激发,促进了前体物的水解[23,24]。只有FVB与BVB的上调差异显著代谢物的数量是高于下调差异显著代谢物的数量。可能与鲜豆荚经过杀青之后细胞和组织结构受到破坏,豆荚的生命活力停止,各种前体物溶出有关[8]。
与FVB相比,分组聚类热图表明,上调差异显著的黄酮类化合物BVB、SVB、DVB随着加工的进行逐渐增多,在陈化阶段有所下降,可能由于陈化期间很多黄酮类化合物参与了多种化学反应和生化反应,导致上调的数量有所下降,而下调差异显著的黄酮类化合物在陈化阶段是最多的,也说明了这一点[11]。上调差异显著的黄酮类化合物包含黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷、黄烷酮,而下调差异显著的黄酮类化合物则还包含黄酮-木脂素,可能是由于随着加工的进行豆荚会发生一系列的酶促反应和非酶氧化,使得黄酮-木脂素下调明显。上调的脂质及其衍生物在SVB、DVB、CVB中包含脂质-甘油磷脂、脂质-甘油酯、脂质-脂肪酸,而BVB只包含脂质-甘油磷脂;BVB、SVB、DVB下调的脂质及其衍生物随着加工的进行逐渐增加,CVB阶段开始下降,可能与脂类的氧化有关。下调的氨基酸及其衍生物随着加工的进行逐渐增多,可能与非酶氧化有关。
代谢组学用于不同加工阶段的香草兰豆荚能够给出大量的代谢物差异数据,这些结果对于分析香草兰加工过程风味形成机理解析具有重要作用,为推断风味成分特别是香草醛的生成途径和发酵过程风味物质的调控提供参考。本研究是首次采用代谢组学分析加工过程的香草兰豆荚,因此如何从大量代谢物结果中分析出调控香兰素等主要风味物质的因素以及它们的形成途径是我们需要进一步加强的工作。