转录因子（transcription factor,TF）又称反式作用因子,可以与真核基因的启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合,是一类在生物体广泛存在的蛋白质分子[1]。转录因子一般由DNA结合区（DNA-binding domain）、寡聚化位点（oligomerization site）、转录调控区（transcription regulation domain）和核定位信号区（nuclear location signal）这4个功能区域组成[2]。MYB转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一,主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育、应答外界坏境和植物刺激等生理过程[3,4,5,6,7]。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用试材均取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部儋州芒果种质圃,以金煌芒为试材。使用的试剂有TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase、rTaq、克隆载体pEASY®-Blunt、大肠杆菌Trans-T1感受态、农杆菌GV3101等。
1.2 方法
1.2.1 芒果果肉总RNA的提取及cDNA的反转录 芒果果肉总RNA的提取参照天根公司生产的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行相关的操作,cDNA合成方法详见全式金公司TransScript®-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书。
1.2.2 MinMYB10基因的克隆 根据前期已经拼接得到的该基因的全长序列,设计上下游特异性引物扩增MinMYB10基因。PCR反应体系：1 μL cDNA模板,上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL,10 μL TaKaRa PrimerSTAR MaxDNA聚合酶和8 μL ddH2O;PCR反应程序：98 ℃预变性5 s;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 6 s,35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存备用。连接pEASY- blunt载体,转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌液送公司测序。
1.2.3 MinMYB10基因的生物信息学分析 利用NCBI上的ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找MinMYB10基因的开放阅读框,并推测其氨基酸序列;运用ExPASy ProtParam软件（https://web.expasy.org/protparam/）分析MinMYB10蛋白理化性质;使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）软件分析氨基酸的疏水性与亲水性;使用DNAMAN和Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）软件分析蛋白质二级结构模型;使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/Interactive/SW3VtZ/models/）在线软件预测并构建MinMYB10蛋白的三级结构模型;利用NCBI上的Blastp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索MinMYB10蛋白的同源序列;使用NCBI中的Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=NG6HM4ME014&mode=all）分析MinMYB10蛋白序列的保守结构域;利用MEGA 7.0软件进行同源序列比对并构建系统进化树。
1.2.4 载体构建 （1）pTRV2-MinMYB10基因沉默载体的构建。首先使用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ对载体pTRV2和目的基因MinMYB10进行双酶切。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,分别将目的基因和酶切后的载体条带进行切胶回收。然后用T4连接酶（全式金公司）22 ℃连接20 min,连接体系为：pTRV2载体片段1 μL,MinMYB10目的基因片段4 μL,T4连接酶0.2 μL,10×T4 Buffer 1 μL,ddH2O 3.8 μL。转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌液扩繁提质粒进行双酶切检测,最后转化GV3101农杆菌感受态,筛选阳性菌液,将菌液与50%的甘油按照体积1∶1混合,于-80 ℃保存。
（2）pGreenII 62-SK-MinMYB10基因过量表达载体的构建。首先使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对载体pGreenII 62-SK和目的基因MinMYB10进行双酶切。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,分别将目的基因和酶切后的载体条带进行切胶回收。然后用T4连接酶（全式金公司）22 ℃连接20 min,连接体系为：pGreenII 62-SK载体片段1 μL,MinMYB10目的基因片段4 μL,T4 连接酶0.2 μL,10×T4 Buffer 1 μL,ddH2O 3.8 μL。转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌液扩繁提质粒进行双酶切检测,最后转化GV3101农杆菌感受态,筛选阳性菌液,将菌液与50%的甘油按照体积1∶1混合,于-80 ℃保存。
2 结果与分析
2.1 金煌芒果果肉总RNA的提取
提取金煌芒果果肉总RNA,用核酸蛋白仪测定其浓度800~1000 ng/μL,纯度OD260/OD280的比值为1.8~2.0,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,有2条清晰完整的条带（图1）。
2.2 MinMYB10基因全长的克隆
以金煌芒完熟期果肉cDNA为模板,以ORF两侧设计引物进行PCR得到MinMYB10基因的cDNA全长。在1.0%琼脂糖凝胶电泳图上,目的片段约1000 bp（图2）,与预期结果一致。测序后,利用ORF finder分析得到基因CDS区为837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量为31.60 ku,等电点为5.89。
2.3 MinMYB10基因序列、同源性、结构域及进化树分析
根据MYB10基因编码蛋白序列,在NCBI上利用Blast P搜索并下载该蛋白的同源序列。选择与MinMYB10同源性较高的物种进行同源比对,物种分别为芒果（Mangifera indica L.）、可可（Theobroma cacao）、榴莲（Durio zibethinus）、亚锦葵（Herrania umbratica）和葡萄（Vitis vinifera）,可了解它们之间的亲缘关系（图3）。使用NCBI上的Conserved domains分析MinMYB10蛋白结构域,结果显示MinMYB10含有PLN03212、Myb_DNA-binding、REB1、SANT和SANT共五个结构域（图4）。采用ProtParam tool软件对MinMYB10蛋白的亲水/疏水性进行了分析,其中MinMYB10蛋白的亲水性平均系数（grand average of hydropathicity）为-0.699,说明该蛋白为亲水性蛋白（图5）。不稳定指数（Ⅱ）计算为56.17,说明该蛋白质分类为不稳定的。使用DNAMAN和Prabi软件对蛋白的二级结构（图6）分析时发现MinMYB10蛋白质具有3种二级结构,其构成为：自由卷曲（Random coil）占53.24%,α-螺旋（alpha helix）占37.41%,伸展片段（extended strand）占3.60%;采用在线软件预测MinMYB10蛋白的三级结构并构建该蛋白的三级结构模型（图7）。利用MEGA 7.0中ClustX多序列比对,邻位相连法构建系统发育树（图8）,结果显示,芒果（MinMYB10）与拟南芥（AthMYB10）是亲缘关系较近的蛋白。
图3 MinMYB10与其他MYB10蛋白的序列比对Fig. 3 Alignment of MinMYB10 with other MYB10 homologous proteins MinMYB10: MYB10 of Mangifera indica L.; TcaMYB10: MYB10 of Theobroma cacao; HumMYB10: MYB10 of Herrania umbratica; DziMYB10: MYB10 of Durio zibethinus; VviMYB10: MYB10 of Vitis vinifera. |
2.4 MinMYB10基因载体的构建
2.4.1 pTRV2-MinMYB10基因沉默载体的构建 首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶扩增基因全长,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带,将pTRV2空载体和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带,然后利用T4连接酶连接回收条带,构建沉默载体pTRV2-MinMYB10,转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌液进行扩繁,之后提取pTRV2-MinMYB10重组质粒,再用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证,酶切目的基因片段为1000 bp（图9A）,与预期结果相吻合,表明pTRV2-MinMYB10重组质粒表达载体构建成功。pTRV2-MinMYB10转化到GV3101农杆菌,菌液PCR检测到目的基因已成功转化到农杆菌菌株（图9B）。
图9 pTRV2-MinMYB10沉默载体的构建M：DL 2000 marker;A：pTRV2-MinMYB10沉默载体的双酶切,1~2：双酶切;B：农杆菌的PCR检测目的条带,1~8：目的条带。 Fig. 9 Construction of the pTRV2-MinMYB10 silencing vector M: DL 2000 marker; A: pTRV2-MinMYB10 double enzyme digestion, 1-2: doubleenzyme digestion; B: PCR detection for the cloned targets in Agrobacterium, 1-8: Target band. |
2.4.2 pGreenII 62-SK-MinMYB10基因过量表达载体的构建 首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶扩增基因全长,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带,将pGreenII 62-SK空载体和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带,然后利用T4连接酶连接回收条带,构建过量表达载体pGreenII 62-SK-MinMYB10,转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中,挑取阳性菌液进行扩繁,之后提取pGreenII 62-SK-MinMYB10重组质粒,再用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切验证,酶切目的基因片段为1000 bp（图10A）,与预期结果相吻合,表明pGreenII 62-SK-MinMYB10重组质粒表达载体构建成功。pGreenII 62-SK-MinMYB10转化到GV3101农杆菌,菌液PCR检测到目的基因已成功转化到农杆菌菌株（图10B）。
图10 pTRV2-MinMYB10表达载体的构建M: DL 2000 Marker; A: pTRV2-MinMYB10表达载体的双酶切; 1~2：双酶切;B: 农杆菌的PCR检测目的条带,1~7：目的条带。 Fig. 10 Construction for pTRV2-MinMYB10 over-expression vector M: DL 2000 Marker; A: pTRV2-MinMYB10 double enzyme digestion; 1-2: doubleenzyme digestion; B: PCR detection for the cloned targets in Agrobacterium, 1-7: Target band. |
3 讨论
MYB转录因子N端含有MYB保守结构域,该区域由50多个氨基酸组成。MYB转录因子含有1~3个不完全重复的串联结构域（R1、R2和R3）[10]。依据MYB结构域的数目不同,MYB转录因子分为4个亚类：1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（four R1/R2）[11]。MYB转录因子虽然在序列上具有一定的保守性,但在不同物种、不同个体或同一个体的不同组织器官中发挥着不同的功能。如：拟南芥中AtMYB21和AtMYB24通过调控植物激素茉莉酸的合成来影响花青素的积累[12]。研究发现杨树的PtrMYB3和PtrMYB20[13],小麦的TaMYB4[14]、水稻的OsMYB46和玉米的ZmMYB31等[15]均参与细胞壁形成。植物中MYB类转录因子主要以R2R3-MYB的形式存在,主要参与植物初生和次生代谢以及对外界刺激和胁迫的应答过程。在模式植物拟南芥中已鉴定出130多个R2R3-MYB基因。在Stracke等[16]的研究中,拟南芥的133个R2R3-MYB基因被划分为24个亚类,其中第10亚类MYB10主要调控花青苷的合成代谢过程。近年来已有研究报道MYB转录因子在苹果（Malus domestica）[17]、樱桃（Prunus avium L.）[18]、草莓（Fragaria ananassa）[19]和葡萄（Vitis vinifera）[20]等果实的花青素合成中起关键调控作用。本研究从金煌芒芒果果肉中克隆得到MinMYB10基因,分析其结构域发现存在两个MYB结构域,属于R2R3-MYB转录因子,并且与其他物种R2R3-MYB家族成员在此区域高度保守,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量为31.60 ku,等电点为5.89,不稳定指数为56.17,为不稳定蛋白。
花青素（Anthocyanins）是一种天然的植物色素,对于植物组织器官呈色具有重要的影响。近年来对花青素的研究也有了一定进展。Vimolmangkang等[21]研究报道过量表达苹果R2R3-MYB转录因子MdMYB3可以促进烟草合成花青素和黄酮醇,使转基因烟草的花色加深。在月季中,R2R3-MYB转录因子RhMYBs4-1和RhMYBs6-1也均可促进花青苷的合成[22]。本研究克隆的MinMYB10具有典型的R2R3结构域,可推测其参与芒果果实花青素的合成过程,对芒果果实花青素合成相关基因进行克隆与表达分析,有助于阐明花青素合成与代谢对芒果果实呈色的调控机理,并进一步构建了沉默表达载体和过表达载体,为更深入解析该基因的功能奠定理论基础。