甜瓜是世界最重要的瓜果之一,栽培周期短、投入产出比较高、增收效益显著[1]。广西地处亚热带季风气候区,年平均气温、年日照时长等多个气候条件都非常适合甜瓜的生长,具有设施栽培反季节甜瓜的明显优势[2]。研究发现,广西甜瓜生产中由于长期不合理的耕作制度与施肥导致甜瓜产区的土壤板结、连作障碍及设施盐渍化等问题日益严重,阻碍了广西甜瓜产业的可持续发展[3]。
木醋液是木材碳化或者干馏过程中产生的烟气经冷凝回流、再分离得到的有机混合物,又被称作植物酸,其主要化学成分为乙酸,同时含有少量的酮类、酚类、酯类、醛类、醇类以及微量金属元素[4]。木醋液主要产出于自然界中的天然木材、植物秸秆和果壳等植物组织,产量十分可观,但不同的植物来源和干馏温度,其得到的木醋液的有机成分比例略有差别。大量研究表明施用不同稀释度的木醋液,能够有效提高土壤肥力水平。木醋液对植物的生长、土壤肥力形成、植物养分转化[5]、提高土壤微生物数量及丰富度同样有着显著的促进作用[6]。张立华等[7]研究发现木醋液对大肠杆菌、青霉菌及石榴干腐病菌均有抑制作用,在低浓度下,木醋液会破坏致病菌细胞结构,导致胞内蛋白质、糖类物质的渗出,杀死细菌。在农业生产上,木醋液可作为植物生长促进剂、土壤改良剂[8]、抗菌剂、杀虫剂、趋避剂[9]等使用。但由于木醋液本身呈酸性,过高的木醋液浓度会对植物产生“烧伤”效果,过低的木醋液浓度则无明显促进效果[10]。适宜稀释度的木醋液能够显著提高植物叶片氮、磷、钾等营养元素的含量,提高植株整体的光合作用,加快有机物质的积累,且对于植物果实的生长发育和糖分的积累有显著的促进作用[11]。秦军等[12]研究表明稀释300~400倍木醋液对梅豆、茄子、辣椒生长量有显著促进作用,并对梅豆有显著增产作用。
木醋液作为国内新兴的纯天然木材加工副产品,其提升农作物品质、改良土壤的效果受到大量学者的关注,然而,国内关于木醋液的研究多集中在作物生长、品质影响等方面,对于施用木醋液改良土壤,尤其是维护土壤健康微环境等方面鲜见报道。
因此,本文针对广西甜瓜产区土壤质量劣化、连作障碍严重、枯萎病频发的问题,通过浇灌不同稀释浓度的木醋液,研究其对甜瓜根系生长、根际土壤生物学性状及细菌多样性的影响,为实现国家“化学肥料和农药双减”政策的顺利实施以及广西甜瓜产业的可持续发展提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
试验甜瓜品种为‘桂甜瓜1号’,种子购买于广西南宁市蔬菜种子市场。试验所用的木醋液购置于河北唐山天地合能源有限公司,颜色为棕褐色,pH为4.3,其主要化学组成及占比为：有机酸（主要为乙酸）：45.3%;酚类物质：26.7%;酮类物质：12.5%;醛类物质：4.97%;醇类：1.69%。试验于2017年4—10月在广西壮族自治区南宁市广西大学农学院蔬菜生产基地（东经108°18′,北纬22°51.2′）温室大棚内进行,采用盆栽方式（直径30 cm,高30 cm）进行种植。供试土壤类型为红壤,土壤性状如下：全氮0.51 g/kg,全磷0.67 g/kg,全钾7.21 g/kg,碱解氮13.17 g/kg,速效磷0.59 g/kg,速效钾51.01 mg/kg,有机质8.42 g/kg,pH 5.71。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 试验设4个处理,每个处理20株：（1）对照组,甜瓜生长期,每隔3 d根系浇灌500 mL清水（CK）;（2）甜瓜生长期,每隔3 d根系浇灌500 mL稀释300倍木醋液（A）;（3）甜瓜生长期,每隔3 d根系浇灌500 mL稀释600倍木醋液（B）;（4）甜瓜生长期,每隔3 d根系浇灌500 mL稀释900倍木醋液（C）。其余施肥、除草、引蔓、授粉、病虫害防治等田间管理按常规方法进行管理。
1.2.2 样品采集及分析 根系样品的收集：定植90 d后,每个处理随机选择5株,采集甜瓜根系,并用蒸馏水缓慢冲洗,根系下放置100目细筛,收集被水流冲洗掉的甜瓜根系。将采集的根系用根系扫描仪（Founder Z2400）进行扫描,获得甜瓜根系图像,并经根系图像分析软件（WinRHIZO Pro 2009c）分析获得甜瓜根系总根长、根系表面积、根尖数、根系体积等相关数据[13]。
根际土壤样品的采集：定植90 d后,每个处理随机选择5株,采用抖根法[14]收集碗豆根际土壤,装入无菌封口袋内,同时分为2份,一份置于4 ℃冰箱保存,用于土壤生物学性状分析;另一份于干冰低温保存,用于根际土壤细菌多样性分析。
1.2.3 土壤生物学性状分析 可培养微生物数量采用稀释平板法[15]进行计数,细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、真菌采用马丁氏琼脂培养基、放线菌采用高氏一号琼脂培养基进行培养。
1.2.4 根际土壤细菌群落结构分析 甜瓜根际土壤样品细菌群落结构分析由上海美吉生物医药科技有限公司测序完成,具体操作流程如下。
（1）总DNA的提取和PCR扩增：土壤微生物总DNA采用Fast DNA SPIN Kit For Soil（MP Biomedicals, Santa Ana, CA）试剂盒提取。具体步骤简述如下：称取1 g土壤样品,按照试剂盒说明书步骤提取总DNA,通过微量紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度,1.8%琼脂糖凝胶电泳检测条带是否合格,并保存于-20 ℃中,供后续实验;PCR扩增采用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rRNA基因V3-V4可变区进行扩增,其扩增程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环27次;72 ℃延伸10 min。PCR反应体系为：0.25 μL TaKaRa Taq（5 U/μL）,5.0 μL 10 × PCR Buffer,4.0 μL dNTPs（各2.5 nmol/L）,1.0 μL（20 μmol /L）引物,2.0 μL DNA模板,加入ddH2O补足50 μL。
（2）Illumina Miseq测序：使用2%的琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Bioscience, UnionCity, CA, USA）进行纯化,Tris-HCL洗脱,2%琼脂糖凝胶电泳检测,利用QuantiFluorTM-ST（Promega, USA）进行定量检测。根据Illumina Miseq高通量测序平台操作流程构建扩增片段文库。
（3）构建文库步骤：首先链接“Y”形接头,然后使用磁珠筛去接头自连片段,再利用PCR扩增进行文库模板富集。
（4）利用高通量测序平台测序。
1.3 数据处理
采用Excel 2010软件和SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计分析,数据以“平均值±标准差（SD）”表示,高通量检测数据通过Usearch（vsesion 7.0）软件以及I-sanger平台进行分析处理,获得Alpha数据表格、细菌群落占比柱形图以及Venn图。
2 结果与分析
2.1 木醋液处理对甜瓜根系生长的影响
由表1可知,与对照相比,木醋液稀释300倍（A）和稀释600倍（B）处理的甜瓜总根长、总根表面积、总根体积、根尖数均显著高于对照。其中,A处理甜瓜根系总根长、总根表面积、总根体积和根尖数分别比对照增加了23.1%、16.1%、16.3%和36.1%;而B处理甜瓜根系总根长、总根表面积、总根体积和根尖数分别比对照增加了48.4%、35.9%、44.1%和65.5%;此外,稀释900倍木醋液处理对豌豆根系的生长除总根表面积显著增加之外,总根长、总根体积与对照之间并无显著差异,而且根尖数显著低于对照;表明木醋液稀释300倍和600倍均具有显著促进甜瓜根系生长的效果,尤其以稀释600倍的促生效果最为显著;而稀释900倍的木醋液则对豌豆根系的生长无显著的促生效果。
表1 不同稀释度木醋液施用下甜瓜根系生长情况Tab. 1 Root growth of muskmelon under different dilutions of wood vinegar application |
| 处理 Treatment | 总根长 Length/cm | 总根表面积 Surf area/cm2 | 总根体积 Root volume/cm3 | 根尖数 Tips |
|---|---|---|---|---|
| CK | 1274.6±32.7c | 259.6±12.5d | 2.93±0.42c | 6237±235c |
| A | 1569.4±48.1b | 301.5±6.7b | 3.41±0.33b | 8492±362b |
| B | 1891.7±54.7a | 352.8±9.1a | 4.22±0.64a | 10324±458a |
| C | 1303.3±28.9c | 261.2±10.7c | 3.06±0.28c | 5873±413d |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatment (P<0.05). | |
注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。 |
2.2 木醋液处理对甜瓜根际土壤生物学性状的影响
2.2.1 木醋液处理对甜瓜根际土壤可培养微生物数量的影响 由表2可知,与对照相比,稀释300 （A）和600倍（B）木醋液处理均显著提高了甜瓜根际土壤中可培养微生物（细菌、真菌和放线菌）的数量。其中稀释300倍（A）和600倍（B）木醋液处理中可培养细菌数量比对照分别增加32.2%、95.2%;可培养真菌数量分别增加46.4%、79.8%;可培养放线菌数量分别增加37.6%、80.7%。稀释900倍（C）木醋液处理对甜瓜根际土壤中可培养微生物数量与对照之间均无显著差异。表明稀释300倍和600倍木醋液处理均能显著提高甜瓜根际土壤中可培养微生物数量,且稀释600倍木醋液处理的提升效果更佳,而稀释900倍木醋液处理对甜瓜根际土壤可培养微生物数量的影响无显著效果。
表2 不同稀释度木醋液施用下甜瓜根际土壤中可培养微生物数量Tab. 2 The amount of soil microorganisms in muskmelon rhizosphere under different dilutions wood vinegar application |
| 处理 Treatment | 细菌 Bacteria/ （106 CFU·g-1） | 真菌 Fungi/ （104 CFU·g-1） | 放线菌 Actinomycetes/（106 CFU·g-1） |
|---|---|---|---|
| CK | 20.11±0.41c | 4.07±0.14c | 19.32±0.69c |
| A | 26.58±0.22b | 5.96±0.27b | 26.59±1.32b |
| B | 39.24±0.36a | 7.32±0.31a | 34.91±0.97a |
| C | 21.63±0.19c | 4.11±0.44c | 20.17±1.34c |
Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment (P<0.05). | |
注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。 |
2.2.2 木醋液处理对甜瓜根际土壤微生物生物量C、N、P的影响 由表3可知,与对照相比,稀释300倍（A）和稀释600倍（B）木醋液处理均显著提高了甜瓜根际土壤中的微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮（MBN）和微生物生物量磷（MBP）。其中,稀释300倍（A）和稀释600倍（B）木醋液处理甜瓜根际土壤中MBC分别增加21.3%、46.5%;MBN分别增加了22.2%、40.7%;MBP分别增加21.4%、32.16%;除MBN外,稀释900倍（C）木醋液处理对甜瓜根际土壤中MBC和MBP的影响与对照之间无显著差异。表明稀释300倍和600倍木醋液处理能够显著提高甜瓜根际土壤中微生物生物量,且以稀释600倍木醋液处理对于甜瓜根际土壤微生物生物量的提升效果尤为显著。
表3 不同稀释度木醋液施用下甜瓜根际土壤微生物生物量Tab. 3 Soil microbial biomass C, N and P in muskmelon rhizosphere under different dilutions wood vinegar application mg·kg-1 |
| 处理 Treatment | 生物量碳 Microbial biomass C | 生物量氮 Microbial biomass N | 生物量磷 Microbial biomass P |
|---|---|---|---|
| CK | 112.92±2.17c | 14.79±1.12d | 18.53±1.41c |
| A | 136.69±3.06b | 18.08±1.36b | 22.50±1.12b |
| B | 165.40±1.90a | 20.82±1.47a | 24.49±1.07a |
| C | 115.35±2.70c | 16.96±1.03c | 19.15±1.22c |
Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment (P<0.05). | |
注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。 |
2.2.3 木醋液处理对甜瓜根际土壤涉及C、N、P循环相关酶活性的影响 由表4可知,与对照相比,稀释300倍（A）和600倍（B）木醋液处理中,甜瓜根际土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶的活性均显著高于对照,分别比对照提高了32.6%、24.4%、24.7%和46.5%、38.5%、33.0%,稀释600倍木醋液处理的提升效果最为显著,另外,稀释900倍（C）木醋液处理中虽然氨肽酶和磷酸酶活性与对照之间呈显著差异,但β-葡糖苷酶活性与对照之间无显著差异,而且3种酶活性均显著低于稀释300倍（A）和600倍（B）处理。表明稀释300倍和600倍木醋液处理均能显著提高甜瓜根际土壤中涉及碳、氮、磷循环相关酶的活性,尤其以稀释600倍木醋液处理提升效果更为显著。
表4 不同稀释度木醋液施用下甜瓜根际土壤酶活性Tab. 4 Soil enzyme activities in muskmelon rhizosphere under different dilutions wood vinegar application nmol·g-1·min-1 |
| 处理 Treatment | β-葡糖苷酶 β-Glucosidase | 氨肽酶 Aminopeptidase | 磷酸酶 Phosphatase |
|---|---|---|---|
| CK | 1.44±0.09c | 16.67±0.12d | 0.97±0.07d |
| A | 1.91±0.04b | 20.73±0.23b | 1.21±0.05b |
| B | 2.11±0.17a | 23.08±0.27a | 1.29±0.11a |
| C | 1.46±0.08c | 17.01±0.19c | 0.94±0.09c |
Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment (P<0.05). | |
注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。 |
2.3 根际微生物细菌群落多样性分析
通过Illumina Miseq高通量测序以及美吉生信云平台计算分析,获得4组处理的细菌Alpha多样性数据以及稀释度曲线。由表5可知,4种处理的覆盖率（Coverage）均达到实验数据分析的要求,数据质量可信。与对照组相比,稀释600倍（B）木醋液处理甜瓜根际土壤中细菌丰富度指数Chao1和多样性Shannon指数均有上升趋势,而Simpson指数有下降趋势。另外,由图1可知,四种处理甜瓜根际土壤中细菌丰富度大小顺序亦表现出稀释600倍（B）木醋液处理细菌丰富度最大,依次分别为稀释300倍液和900倍液及对照。表明稀释600倍木醋液处理最有利于提高甜瓜根际土壤中细菌的丰富度和多样性,其次为稀释300倍,而稀释900倍对甜瓜根际土壤细菌多样性和丰富度的影响已与清水无异。
表5 不同稀释度木醋液施用下甜瓜根际土壤细菌的多样性指数Tab. 5 Diversity index of bacteria in muskmelon rhizosphere soil under different dilutions wood vinegar application |
| 处理 Treatment | 序列 数目Reads | 97% | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| OTU | Chao1 | Coverage | Shannon | Simpson | ||
| CK | 32985 | 3304 | 4283.46 | 0.969 | 6.80 | 0.0031 |
| A | 38512 | 3613 | 4531.47 | 0.963 | 6.95 | 0.0025 |
| B | 46365 | 3749 | 4571.47 | 0.959 | 6.99 | 0.0025 |
| C | 31294 | 3311 | 4249.44 | 0.968 | 6.97 | 0.0038 |
2.4 优势细菌群落分析
2.4.1 基于门分类水平的优势细菌群落组成分析 基于Illumina Miseq分析,4组处理共获得46门、128纲、217目、406科、739属细菌。门分类水平上（图2）,相对丰度大于1%的细菌共有11种,分别为：变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、糖化细菌门（Sacchari bacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、奇古菌门（Thaumarchaeota）、疣微菌门（Verru comicrobia）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）。其中,变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门均是木醋液和对照处理甜瓜根际土壤中细菌占比大于或接近10%的优势菌门,表明不同稀释浓度的木醋液处理没有改变甜瓜根际土壤中细菌优势菌门的组成,仅细小地改变了细菌优势菌门的占比。
2.4.2 基于属分类水平的优势细菌菌群分析 由图3可知,对照及不同稀释浓度木醋液处理土壤中相对丰度大于1%的细菌属分别为：Subgroup 6_no rank、Saccharibacteria、Gemma timonadaceae（芽单胞菌属）、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Soil Crenarchaeotic Group、Bacillus（芽孢杆菌属）、Rhodospirillaceae（红螺菌属）、Roseiflexus（玫瑰弯菌属）、Lactococcus（乳球菌属）和Acidimicrobiales。表明施用不同稀释浓度的木醋液仅细微地改变了甜瓜根际土壤中细菌优势菌属的占比,但没有改变优势菌属组成。
2.4.3 基于OTUs（97%）Venn图分析 Venn图可以反映环境样品的相似性及重叠情况,由图4可知,不同处理土壤样品的共有OTU值为4788个。其中,稀释300倍（A）木醋液处理所含的独立OTUs数值最大为307个,占总OTUs的6.41%;依次分别为稀释600倍（B）木醋液处理286个,占总OTUs的5.97%;C处理268个,占该处理总OTUs的5.60%;对照的独立OTUs数目最小,为251个,占总OTUs的5.24%。表明施用不同稀释浓度的木醋液处理虽然没有显著改变甜瓜根际土壤中细菌的优势菌属组成,但数目更多的独立OUT表明木醋液处理有助于甜瓜根际土壤形成细菌群落结构更为多样的微环境,从而有利于提高甜瓜抵御土传病害的能力。
3 讨论
植物根系的生长可有效指示植株整体的生长状态[18]。植株在生长过程中,地上部分和地下部分都会因外界环境的不同而发生改变,即植株生长具有可塑性,可通过调节自身的形态来适应外界环境的变化[19]。当外界环境可提供更多的养分时,植株的根系生长快速、根系分支增加,实现土壤肥力资源的优化配置[20]。本研究发现施用稀释300倍或600倍木醋液,均显著提高了甜瓜植株根系总根长、总根表面积、总根体积和总根尖数;另一方面,施用稀释900倍的木醋液对甜瓜根系生长的影响与对照组相比无显著差异,表明木醋液虽然具有促进植株根系生长的效果,但木醋液的稀释浓度是左右其对于植株根系促生效果的重要因素,这一结果与李忠徽[21]、郜天磊等[22]的研究结果相一致。
韦强等[23]的研究发现：浇灌稀释200倍竹醋液可有效促进黄瓜根系的生长发育,而浓度过高或过低,促进作用均会减弱;邹小明等[24]的研究表明0.5%浓度的竹醋液对于荒地土壤中微生物的生长具有显著促进作用,而高于2%的竹醋液处理对土壤酶活性、微生物数量都存在抑制效应。本研究发现,施用稀释600倍的木醋液显著提高甜瓜根际土壤中可培养微生物数量、土壤酶活性和和微生物生物量。其原因可能是木醋液中含有酮类、酚类、酯类、醛类、醇类等有机物质以及微量金属元素,这些有机物及微量元素为存在于根际土壤的微生物以及植物生长提供了充足的养分,但木醋液若没有稀释,直接施入土壤,其主成分乙酸可能会导致局部土壤pH急剧降低,不利于作物的生长而形成抑制效应。
土壤微生物数量巨大,包括细菌、真菌和放线菌,但以细菌居多,约占微生物总量的70%~ 90%。因此,土壤细菌多样性与土壤的健康状况紧密相关[25]。本研究发现,与对照组相比,施用不同稀释浓度木醋液均没有改变甜瓜根际土壤中细菌的优势菌门和菌属,而且施用稀释600倍的木醋液还有助于提高甜瓜根际土壤中细菌的丰富度和多样性指数,增加了独立细菌OTUs数量。曲再红等人研究发现稀释100倍的木醋液通过增加土壤微生物的数量（尤其是细菌和放线菌的数量）,具备抑制土壤中番茄早疫病病原菌的能力,从而对番茄早疫病间接达到防治的作用[26],这一结果与本研究结果具有相似之处。另一方面,基于门分类水平的优势细菌群落组成分析发现,木醋液及对照处理甜瓜根际土壤中的优势菌门均为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和硝化螺旋菌门;同样基于属分类水平发现,木醋液和对照处理甜瓜根际土壤中细菌的优势菌属均是Subgroup 6_no rank、Saccharibacteria、Gemma timonadaceae（芽单胞菌属）、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Soil Crenarchaeotic Group、Bacillus（芽孢杆菌属）、Rhodospirillaceae（红螺菌属）、Roseiflexus（玫瑰弯菌属）、Lactococcus（乳球菌属）和Acidimicrobiales,木醋液处理和对照之间优势菌属组成并无显著差异,仅仅提高了部分优势菌门或菌属的比例,表明木醋液处理并没有显著改变甜瓜根际土壤中细菌群落组成。
综上所述,稀释600倍木醋液处理不仅显著促进甜瓜根系生长、显著提高甜瓜根际土壤中可培养微生物数量以及微生物生物量碳、氮、磷和涉及土壤碳、氮、磷循环相关酶的活性,而且有效地提高了甜瓜根际土壤细菌丰富度Chao 1指数和Shannon指数,增加了根际土壤中微生物多样性[27];另一方面,门或属分类水平上,无论施用不同稀释浓度的木醋液,其优势菌门、属与对照之间无显著差异。表明施用木醋液没有改变甜瓜根际土壤中细菌的组成,但稀释300倍或600倍木醋液更有利于甜瓜根际土壤形成细菌群落结构更为多样的微环境。综合甜瓜根系生长及指示根际土壤肥力指标的生物学性状,施用稀释600倍的木醋液更有助于促进甜瓜生长、提高甜瓜根际微环境的土壤肥力和抵御土传病害的能力。