芡实（Euryale ferox Salisb.）,俗称鸡头,是睡莲科芡属多年生水生草本植物,原产东亚。在我国,芡实主要分布于黄河以南,常见于长江流域和珠江流域的湖塘沟渠。我国芡实的栽培历史悠久[1],目前江苏、江西、湖北等地都有很大的栽培面积,种植效益可观。在植物分类学上,芡属只有芡实一个种;栽培上,一般根据果实刺的有无分为有刺种和无刺种[2,3]。芡实主要以种仁供食用。有刺种种子和种仁较小,欠整齐,粳性,品质中等。无刺种种子和种仁较大,糯性,品质优[4]。芡实种仁营养价值高,民间认为有延年益寿之功效,被奉为上品[5]。
淀粉是芡实种仁的主要贮藏物质,占干物重的70%以上,其颗粒结构及功能特性对芡实品质及加工条件起着决定性作用[6]。芡实种仁的支链淀粉含量以及直链和支链淀粉的比例在各品种间有显著差异,其淀粉的糊化温度在72.37~86.35 ℃之间[7,8,9]。
淀粉分支酶（starch branching enzyme,SBE）能够在葡聚糖链上引入α-1,6糖苷键,使之产生分支结构,是合成淀粉分支的关键酶,其活性高低影响支链淀粉的含量及链长,故该酶被认为能影响植物淀粉的精细结构[10,11]。有关SBE的研究较多：皱缩豌豆中SBEI活性的丧失会限制淀粉的早期合成,从而对淀粉颗粒的形态造成影响[12];通过抑制淀粉分支酶SBEIIb基因的表达,玉米中支链淀粉的合成受到了影响,直链淀粉含量提高了50%[13];转SBEI基因的稻米直链淀粉含量与对照相比平均降低了15%,籼稻中导入反义SBE基因后,T1代转基因植物的成熟种子中直链淀粉含量较正常植株含量有所提高,淀粉品质发生明显改变[14]。
本研究以‘紫花苏芡’和‘紫花刺芡’为试材,研究芡实种仁发育过程中支链淀粉含量变化、淀粉粒形成及淀粉糊化特性;同时克隆GeSBE1、分析其功能结构,以及该基因在芡实种仁的发育过程的表达特性,以期为探明GeSBE1在芡实种仁发育过程中支链淀粉合成和品质形成的作用机制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为‘紫花苏芡’和‘紫花刺芡’,种植于扬州大学水生蔬菜试验基地,正常栽培管理。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 采取花后10、15、20、25 d的发育正常的芡实果实,在冰块上迅速剥取种仁。用于cDNA克隆及基因表达分析的种仁立即用液氮冷冻后置-80 ℃冰箱保存。用于淀粉体电镜观察的种仁则经双面刀片切取成大约1 mm×1 mm× 4 mm见方的长方体小块后,立即投入0.1 mol/L戊二醛固定液中,置于0~4 ℃下冷藏。用于淀粉含量测定的种仁则迅速放入烘箱105 ℃杀青1 h,之后在60 ℃恒温下烘干。作糊化特性的测定的种仁取自花后20 d的种子,待自然晾干至恒重后粉碎备用。
（2）芡实淀粉的糊化特性：用澳大利亚Newport Scientific仪器公司生产的RVA（Rapid Visco Analyzer, Model 3D）快速测定淀粉黏滞特性,并用TCW（Thermal Cycle for Windows）配套软件分析。样品操作参照Standard 2的规程。
（3）芡实种子发育过程中淀粉体形成的扫描电镜观察：从戊二醛固定液中取出芡实种仁长方体小块,用双蒸水清洗3次,每次15 min,之后用锇酸固定3 h,再用双蒸水清洗（方法同上）,后经丙酮逐级脱水,置于乙醇与乙酸戊酯（1∶1）的混合液中浸泡20 min,然后置于乙酸戊酯中浸泡30 min,之后进行CO2临界点干燥。干燥后用双面刀片在长方体小块中部轻轻划一道痕,用镊子沿划痕将小块掰成两块,将断开的两块的断裂面朝上用双面胶黏贴,置载物台上,在IB-3型离子溅射仪内对样品断裂面喷金后,用Philips XL30-ESEM型环境扫描电子显微镜观察淀粉粒形态与结构,并照相。电镜加速电压为20 kV。
（4）GeSBE1 cDNA 3′和5′端序列的获得：使用TAKARA MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒进行芡实RNA的提取。使用3′-Full RACE Core Set Ver2.0试剂盒、5′-Full RACE Kit试剂盒（TaKaRa公司）进行反转录,合成cDNA（具体合成过程及条件完全参照试剂盒说明）。
根据实验室芡实转录组测序得到的GeSBE1序列片段,设计3′端RACE引物,上游引物（5′-AGTTGGTTGCGACTTGCC-3′）,下游引物为Oligo(dT)18;5′端RACE引物（5′-CAGCAGGAG CCCATTCACGATAAACTA-3′）反应体系参考TaKaRa公司的3′和5′试剂盒步骤进行操作。将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞,在氨苄培养基上进行培养,挑取单克隆菌落,送至擎科生物科技（南京）有限公司测序。
（5）GeSBE1荧光定量qPCR的表达分析：根据GeSBE1 cDNA序列设计特异性引物,上游引物（5′-TGGATGTCGTTCACAGCCATGC-3′）、下游引物（5′-CCTCAAGCCACCACCTCAAGTT AG-3′）,扩增片段长度为198 bp。根据芡实转录组测序得到的β-actin基因序列,设计内参引物,上游引物（5′-ATGAAGATACTCACGGAAAGGG GT-3′）、下游引物（5′-GGACATCGGAAACGCT CA-3′）。qPCR参照荧光定量试剂盒 SYBR premix EXTagTM reagent（TaKaRa）说明书进行。
1.3 数据处理
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析;并采用Excel 2010软件制图。
2 结果与分析
2.1 芡实种仁发育过程中支链淀粉含量变化
在芡实种仁的成熟过程中,支链淀粉的含量均呈上升趋势（图1A）。‘紫花苏芡’种仁的支链淀粉含量在花后15~20 d时增加速度最快,增加幅度为36.2%;‘紫花刺芡’种仁支链淀粉在花后10~15 d时增加最快,之后增加的幅度趋于平缓。在花后25 d种仁达鲜食成熟时,‘紫花苏芡’支链淀粉的含量达48.30%;显著高于‘紫花刺芡’的38.82%。
图1 ‘紫花刺芡’与‘紫花苏芡’种仁发育过程中的支链淀粉含量（A）及支链淀粉与直链淀粉比值（B）的变化不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。 Fig.1 Changes in the amylopectin content and the ratio of amylopectin to amylose content in the seed kemels during seed development of “Zihua Suqian” and “Zihua Ciqian” (A) Changes in amylopectin content and changes in the ratio of amylopectin to amylose content (B) Different lowercase letters indicate significant difference at p<0.05. |
芡实种仁的发育过程中,支链淀粉含量与直链淀粉含量的比值呈下降趋势（图1B）。‘紫花苏芡’的支链淀粉含量与直链淀粉含量的比值始终显著高于‘紫花刺芡’,这与‘紫花苏芡’的种仁糯性,‘紫花刺芡’的种仁粳性表现一致。在花后15~20 d,‘紫花苏芡’种仁中支链淀粉与直链淀粉比值的快速下降,降幅达16.5%,相比之下,‘紫花刺芡’中的下降幅度较小。至花后25 d种仁鲜食成熟时,‘紫花苏芡’和‘紫花刺芡’支链淀粉和直链淀粉含量的比值分别为2.55和1.79,差异显著。
2.2 芡实发育过程中淀粉粒的形态
表1 芡实种仁成熟过程中淀粉粒的大小Tab. 1 The sizes of starch grains in the seed kemel development of the two gordon euryale cultivars |
| 品种 Variety | 花后天数 Days after anthesis/d | 平均直径 Average- diameter/µm | 直径区域 Diameter range/µm | 变异系数 Coefficient of variation |
|---|---|---|---|---|
| 紫花苏芡 Zihua Suqian | 10 | 1.97 | 1.96~2.06 | 0.06 |
| 15 | 2.06 | 1.90~2.23 | 0.45 | |
| 20 | 2.15 | 2.01~2.17 | 0.20 | |
| 25 | 2.17 | 2.07~2.26 | 0.15 | |
| 紫花刺芡 Zihua Ciqian | 10 | 1.65 | 1.30~1.70 | 1.18 |
| 15 | 1.84 | 1.63~2.03 | 1.06 | |
| 20 | 2.00 | 1.60~2.26 | 1.19 | |
| 25 | 2.05 | 1.59~2.41 | 1.13 |
图2 两芡实品种种子发育过程中种仁淀粉粒形态和大小变化A1~A4：‘紫花苏芡’种仁花后10、15、20、25 d时淀粉粒的形态（10 000×）;B1~B4：‘紫花刺芡’种仁花后10、15、20、25 d时淀粉粒的形态（16 000×）。 Fig. 2 Changes in morphology and sizes of the starch grains in seed kemels during seed development of the two gordon euryale cultivars A1-A4: The starch grains in seed kemel of ‘Zihua Suqian’ at 10 days, 15 days, 20 days, 25 days postanthesis (10 000 ×); B1-B4: The starch grains in seed kemel of ‘Zihua Ciqian’ at 10 days, 15 days, 20 days, 25 days postanthesis (16 000 ×). |
2.3 芡实种仁淀粉的糊化特性
表2列出了‘紫花苏芡’和‘紫花刺芡’淀粉糊化特性。‘紫花苏芡’淀粉黏度开始变化的时间比‘紫花刺芡’早0.3 min,糊化温度为85.65 ℃,比‘紫花刺芡’低0.7 ℃,表明其糊化所需能量较低,易于糊化。‘紫花苏芡’的峰值黏度达2611 cp,高于‘紫花刺芡’257 cp,这与‘紫花苏芡’支链淀粉含量高于‘紫花刺芡’相符。‘紫花苏芡’的崩解值大于‘紫花刺芡’,表明其淀粉在高温下耐剪切的能力较弱,热黏度稳定性较差,口感较软黏。‘紫花刺芡’的冷胶黏度为2941 cp高于‘紫花苏芡’,淀粉糊的硬度较大,口感差。
表2 芡实淀粉黏度曲线特征值Tab. 2 RVA eigenvalues of the two gordon euryale cultivars |
| 品种 Variety | 峰值黏度 Peak viscosity/cp | 热浆黏度 Hot paste viscosity/cp | 崩解值 Breakdown /cp | 冷胶黏度 Cool paste viscosity/cp | 消减值 Consistence /cp | 回复值 Setback /cp | 峰值时间 Peak time/min | 糊化温度 Pasting temperature/℃ |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 紫花苏芡 Zihua Suqian | 2611 | 1682 | 813 | 2854 | 548 | 1331 | 5.07 | 85.65 |
| 紫花刺芡 Zihua Ciqian | 2254 | 1523 | 731 | 2941 | 600 | 1361 | 5.33 | 86.35 |
2.4 GeSBE1 cDNA的克隆
2.5 GeSBE1序列分析
将GeSBE1基因的cDNA序列在NCBI数据库进行Blastn后发现,该序列与莲藕SBEI（NW001302849.1）相似度达78%,与高粱、水稻、小麦等的相似度均达到70%~77%,由此可见SBE基因在不同植物中具有较高的保守性。
利用ProtParam软件（http://au.expasy.org/ tools/protparam.html/）对芡实淀粉分支酶氨基酸序列进行分析,GeSBE1编码的蛋白分子量为94.3 ku,理论等电点为5.44,带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为117个,带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为86个,总平均亲水性为-0.475,为亲水性蛋白,不稳定系数为31.38,为稳定蛋白。其第242~650个氨基酸组成了GeSBE1的淀粉酶催化域,包括420~540个左右的氨基酸构成的活性位点和催化位点（图5）。
2.6 GeSBEI表达分析
芡实种仁的发育过程中,GeSBE1表达呈先上升后下降的趋势。其中,‘紫花刺芡’在花后15 d表达量达到峰值,而‘紫花苏芡’直至花后20 d才达到表达峰值;在花后15 d后,‘紫花刺芡’的表达量显著下降,降幅达到43.44%。种仁发育过程中,‘紫花苏芡’GeSBE1的表达量总体高于‘紫花刺芡’,与种仁发育过程中‘紫花苏芡’支链淀粉含量始终高于‘紫花刺芡’的结果相符;花后第10、15天,二者GeSBE1的表达量差异不显著,但花后第20、25天,‘紫花苏芡’GeSBE1的表达量仍然保持高水平,而‘紫花刺芡’的表达量快速下降,‘紫花刺芡’的表达量分别仅为‘紫花苏芡’的43.94%和50.84%。
3 讨论
3.1 芡实种仁发育过程中支链淀粉特性
淀粉的悬浮液在加热过程中,淀粉粒吸水膨胀破裂,淀粉分子在溶液中形成具有黏度的糊状物,这种现象叫做淀粉的糊化。淀粉的糊化与淀粉粒的结构有关,由于淀粉粒中存在由直链淀粉构成的结晶区和支链淀粉构成的无定形区,结晶区是热力学稳定结构,因此淀粉中直链淀粉含量越高,糊化所需的能量越高,反之越低[20]。糊化过程中黏度的变化可分为4个阶段。①在加热过程中,水分从淀粉粒的孔隙中进入,与部分极性基团相结合,黏度曲线变化平缓[21]。②当温度达到糊化温度时,淀粉粒开始大量吸水出现不可逆的膨胀,淀粉粒外围的支链淀粉层出现胀裂,淀粉悬浮液变成高黏度糊浆,破碎的支链淀粉层形成凝胶,颗粒内部的直链淀粉游离出来形成溶胶,淀粉悬浮液呈现黏稠状,黏度曲线迅速上升,支链淀粉含量越高,淀粉的峰值黏度越高[22]。③在淀粉糊化后继续加温或者保持温度,溶液从凝胶态变为溶胶态,黏度下降,出现稀懈现象,这个黏度降低过程的终点称为热浆黏度,崩解值表示淀粉糊黏度热稳定性的变化[23]。④当温度下降,分子运动减慢,分散的淀粉分子开始重新结合,溶液出现胶凝现象,淀粉糊的黏度上升,支链淀粉的含量与冷胶黏度呈反比[24]。淀粉黏滞性（RVA）特征值中的峰值黏度的高低主要是由淀粉粒的结构决定的,淀粉粒的骨架由支链淀粉构成,研究表明淀粉粒中支链淀粉含量越高在糊浆中形成的凝胶越多,淀粉的黏度则越高[25]。本研究发现,‘紫花苏芡’种仁淀粉峰值黏度更高,崩解值更大,淀粉易于糊化,种仁食用品质较好。在小麦食用品质与淀粉糊化特性的研究中,同样发现RVA的峰值黏度与面条的弹性、韧性和食用品质呈极显著正相关,崩解值与面条的品质呈显著负相关[26]。淀粉粒的大小不均是导致稻米品质性状下降的一个重要原因,淀粉粒直径的变异系数可作为衡量米质优劣的间接指标,优质稻米中,单淀粉粒为棱角分明的多面体,粒间排列紧密,劣质稻米中多数淀粉粒形状近圆形,棱角较少,排列疏松[27]。‘紫花苏芡’种仁中淀粉粒大小相对均匀,变异系数低,且棱角分明,排列紧密,糯性,而‘紫花刺芡’淀粉粒多数呈圆形,粳性,这与前人[28]在糯小麦和非糯小麦的淀粉粒形态研究中发现,糯小麦的B型淀粉粒主要呈现不规则多边形状,非糯小麦主要呈圆球状的结果相似。
3.2 GeSBEI在芡实种仁淀粉合成过程中的作用
淀粉分支酶（SBE）又称Q酶,是形成支链淀粉的关键酶,有SBEI和SBEII两种同工型,SBEI倾向于以直链淀粉作为底物,而SBEII对支链淀粉的亲和力高[29]。SBE既可以与淀粉粒结合而存在,也可以以游离态存在于基质中[30]。本研究克隆获得的GeSBE1的cDNA序列全长为2796 bp,编码821个氨基酸,蛋白分子量为94.3 ku,cDNA序列与莲藕SBEI相似度最高达78%,推测克隆得到的GeSBE1可能属于SBEI型,可能对直链淀粉亲和力更高,可将较长的糖链转移到直链淀粉上产生分支,形成支链淀粉[30]。在‘紫花苏芡’种仁的发育过程中,GeSBE1的表达量始终保持高水平,这可能直接导致其支链淀粉的含量以及支链淀粉与直链淀粉比值均明显高于‘紫花刺芡’。由于花后20 d‘紫花苏芡’和‘紫花刺芡’中GeSBE1的表达量表现出显著差异,表明该发育时期可能是影响芡实淀粉品质的重要时期;以上结果表明,芡实GeSBE1可能在调控支链淀粉的合成并最终对芡实种仁品质起重要作用。
本研究发现支链淀粉含量、支链淀粉与直链淀粉的比例、淀粉糊化特性和淀粉粒的形态结构是影响芡实种仁品质性状的重要指标,尤其是支链淀粉与直链淀粉的比例在较大程度上决定了淀粉的物理化学特性,从而决定芡实种仁的淀粉品质;SBE作为支链淀粉合成中的关键酶,能够切开寡糖片段,同时又能将切开的短链连接到受体链上,形成分支结构,对支链淀粉含量及链长起着重要作用,是影响芡实淀粉品质的重要基因。这为今后深入挖掘GeSBE1基因功能,探明GeSBE1基因与芡实支链淀粉合成和结构的关系,解析GeSBE1调控芡实淀粉品质的分子机制提供了一定的理论依据。