桉树是重要的造纸用材,我国是纸浆进口大国,对外依存度较高。低温限制了桉木的种植区带,研究桉木应对低温胁迫的防御机理和作用机制,制定具有指导性意义的防控措施和培育耐寒能力强的桉树新品系,以提高桉树的木材产量,缓解我国造纸用材的供求问题,具有重要社会效益和经济意义。
谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,简称GR）催化生成还原型谷胱甘肽（GSH）,在非生物胁迫下植物中的GR活性会显著增加,保护细胞免受生物胁迫引起的氧化破坏[1],以维持较高水平的还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽比（GSH∶GSSG）[2]。
大量的研究数据表明GSH的含量与植物的耐低温能力直接相关联。雪松在冬季总GSH含量增加[3],高山植物随海拔的升高其体内的谷胱甘肽含量增加[4];番茄[5]、高粱[6]、玉米[7]的GSH含量和GSH∶GSSG比率在耐寒能力强的植株中较高;研究玉米耐低温能力与总GSH含量和GR活性关系的结果表明二者呈正相关[8],用5 μmol/L作物安全剂提高玉米25%的耐低温能力,总GSH含量和GR活性均增加,此时增加丁亚胺浓度,植物体内出现GSH合成抑制因子,玉米体内的总GSH含量和GR活性均急速下降,玉米的耐低温能力也下降了31%;定位于杨树的叶绿体中正义表达GR基因,杨树体内GSH含量增加,低温胁迫下杨树的光抑制耐受能力增强[9],这些研究数据表明较高的GSH含量提高了植物的抗寒能力。但有关巨尾桉GR基因的研究未见报道。
本文研究了巨尾桉EuGR1基因的表达特性,分析了低温胁迫下EuGR1基因与巨尾桉耐低温能力的关联性,为培育抗寒巨尾桉植株提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和载体 载体pET-32a(+)、菌株E. coli BL21,巨尾桉组培苗及温室苗为本实验室保存。
1.1.2 试剂 Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plant RNA Extraction Kit、One Step PLUS RT-PCR Kit均购自宝生物(大连)有限公司;其他试剂和耗材购自上海生工有限公司。
1.2 方法
1.2.1 桉树GR基因的克隆 利用CTAB法[10]提取巨尾桉叶片总RNA,Poly(A) mRNA 纯化试剂盒（上海生工）纯化总RNA,合成cDNA第一链并以引物GSH2F：ATGGCGAGGAAGATGCTGAT
TGAT,GSH2R：TTACAGATTGGTCTTAGGCTT
GGG扩增目的条带,回收目的片段与pMD18-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α感受态并筛选阳性克隆子,委托华大基因公司测序。
1.2.2 表达载体的构建与表达 以引物EuGR12F：5°-GTCGACATGGCGAGGAAGATGCTGATTGAT-3°,EuGR12R：5°-CTCGAGTTACAGATTGGTCTTAGGCTTGGG-3°扩增目的片段,与pET-32a(+)连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性质粒。参考文献[11]中的方法研究GR基因的原核表达体系。
1.2.3 GR酶活性测定 蛋白酶粗酶液提取和测定参考文献[11]中的方法,谷胱甘肽还原酶的一个酶活力单位定义为25 ℃、pH 7.6、1 min内还原1 μmol/L GSSG,计算GR酶活性公式如下：
\[GR总活性（U/mg）= \frac{[{{A}_{340}}_{sample}-{{A}_{340}}_{blank}]\times X}{W\times 0.006\ 22}\]
A340 sample：样品吸光度;A340 blank：对照吸光度;X：稀释倍数;W：样品蛋白质含量（mg/mL）。
1.2.4 实时定量PCR分析表达量 qPCR方法参见文献[10],内参基因设计为巨尾桉18s rRNA,引物序列为Eg18S3：5°-CATGGCCGTTCTTAGTT
GGT-3°;Eg18S4：5°-TAGCAGGCTGAGGTCTCG
TT-3°;EgGR1：5°-GGGTGAATTGGAGGATGCA
A-3°;EgGR2：5°-CAGCATTTGCCAACAATCGC- 3°。实验材料取实验室保存的温室苗和组培苗做叶龄和根茎叶的表达特性分析,以实验室筛选的抗寒的2种转基因巨尾桉株系pBI-eSOD（大量表达EuCuZnSOD1基因,简称P）和pBD-anti- 4CL-eCSD1（大量表达EuCuZnSOD1基因+反义阻断4CL1基因,简称F）为实验材料,以常温下、4 ℃处理36 h、4 ℃处理48 h后的叶片为模板分析EuGR1基因的表达量,以CK为对照计算数据。
1.3 数据处理
采用2-∆∆CT法计算实时定量PCR的实验数据。
2 结果与分析
2.1 巨尾桉GR基因的克隆与原核表达载体构建
根据巨桉基因组数据,预测巨尾桉GR基因大约为1500 bp,筛选阳性克隆子经（委托华大基因公司）测序后,在NCBI申请基因注册GenBank Accession Number: KU904639。利用WOLF- PROST在线软件分析巨尾桉GR基因定位于植物细胞质表达（图1）。设计Sal1、Xho1连接EuGR1和pET-32a(+),因为pET-32 a(+)多酶切位点的Hind Ⅲ已被切除,而在EuGR1的1464 bp处存在一个Hind Ⅲ单酶切位点,所以用Hind Ⅲ对重组质粒pET-EuGR1进行单酶切验证是否连接成功（图2）,Hind Ⅲ酶切后出现一条大小约为7500 bp的单一条带,说明EuGR1与pET-32 a(+)连接成功。
2.2 巨尾桉GR基因的原核表达
巨尾桉EuGR1基因全长1485 bp,编码494个氨基酸,蛋白表达大小为55 ku,加上表达载体的标签蛋白,预测融合蛋白大小为60 ku。图3为pET-EuGR1经IPTG诱导表达的SDS-PAGE图,在55~70 ku之间有一条明显的蛋白条带,表明EuGR1在原核中诱导表达。
图3 pET-EuGR1在E. coli BL21中诱导表达的SDS-PAGE电泳图M：蛋白Marker;1：1.0 mmol/L IPTG诱导E. coil BL21;2：E. coil BL21;3：1.0 mmol/L IPTG诱导pET-EuGR1;1：pET-EuGR1;5：1.0 mmol/L IPTG诱导pET-32a(+);6：pET-32a Fig. 3 The SDS-PAGE of pET-EuGR1 expression in E. coli BL21 M: Protein marker; 1: E. coil BL21(with 1.0 mmol/L IPTG); 2: E. coil BL21; 3: pET-EuGR1 (with 1.0 mmol/L IPTG); 4: pET-EuGR1; 5: pET-32a(+)(with 1.0 mmol/L IPTG); pET-EuGR1 |
2.3 EuGR1酶活性检测
分别将含pET-EuGR1、pET-32 a(+)以及空载的E. coli BL21三种菌株在0.1 mmol/L IPTG、37 ℃诱导4 h,室温下测定谷胱甘肽还原酶活性。图4中转化菌株pET-EuGR1的GR酶活力比含pET-32 a(+)菌株的GR酶活力增加了1.36倍,比空载的E. coli BL21的GR酶活力增加了1.13倍,表明含有重组外源载体pET-EuGR1的大肠杆菌能够诱导GR蛋白表达,且具有生物学活性。
2.4 EuGR1基因在巨尾桉中的表达特性
以巨尾桉组培苗叶、茎、根的RNA作模板,以叶的EuGR1表达量为对照,计算茎、根中EuGR1相对表达量倍数。EuGR1在巨尾桉组培苗的茎中表达量最高,其次为叶片,在根中表达量最低（图5）。
取巨尾桉温室苗幼叶、中龄叶、老龄叶3个样本的RNA为模板,以幼叶EuGR1的表达量为对照,相对定量中龄叶、老龄叶EuGR1的表达量（图6）。EuGR1在幼叶中表达量最大,其次是中龄叶和老龄叶,说明巨尾桉EuGR1在初生组织表达量较大,随着叶片的衰老而表达量减少。
2.5 4 ℃低温胁迫下EuGR1的表达特性
实验结果表明,耐寒能力较强的转基因植株EuGR1表达量较高,P36的耐寒能力最弱,EuGR1表达量最低。但是耐寒能力较强的P40、P41、P52、F44、F52转基因植株中EuGR1表达量随着低温胁迫时间的延长,均呈现表达量下降的趋势,耐寒能力和寒害恢复能力最强的P40植株,在低温胁迫48 h后与常温相比EuGR1表达量下降了85%,但是并非表达量下降最大的植株,表达量下降最大的植株是F52 ,低温胁迫48 h后EuGR1 表达量下降了93%,耐寒能力和寒害恢复能力最弱的P36植株中,EuGR1表达量表现为先降低后升高。这些结果表明EuGR1的表达量受低温胁迫的影响较大,4 ℃低温胁迫下表达量随着时间的延长表达量降低（图7）。
3 讨论
本研究克隆了巨尾桉定位于细胞质表达的GR1基因,通过qPCR数据表明该基因的表达特性有别于其他植物的表达模式。橡胶树中GR1定位于细胞质中高表达,叶片中表达量低;GR2在细胞质中表达量较低,叶片中高表达,且其表达量与叶片的生长发育呈正相关[11]。拟南芥的基因组经分析发现GR1定位于细胞质或过氧化物酶体中,与植物的生长发育关联度较小,GR2定位于质体（线粒体）中,对根及顶端分生组织的生长具有重要作用[12]。在本研究中qPCR的结果表明巨尾桉细胞质EuGR1基因在细胞分化生长旺盛的部位表达量较大,如幼叶、茎中的表达量较大,猜测该基因参与植物的生长发育以及营养物质运输等功能,这与其他植物的研究结果存在差异。
本研究选取6株编号为P36、P40、P41、P52、F44、F76的转基因巨尾桉[13],耐寒能力强的株系EuGR1的表达量较高（如P40、P41、P52）,耐寒能力弱的株系EuGR1的表达量较低（如P36、F44、F76）,说明EuGR1的表达量与转基因植株的耐寒性有相关性,这与之前其他植物的研究结果是相符的。但是转基因巨尾桉植株在4 ℃持续低温胁迫下,EuGR1表达量表现为持续下降,特别是耐寒能力和恢复能力较好的株系下降程度较大,例如P40和P41号株系在4 ℃、36 h时EuGR1表达量相比常温表达量分别下降了52%和68%,4 ℃、48 h时EuGR1表达量相比常温表达量分别下降了84%和89%,推测原因可能是本研究克隆的巨尾桉EuGR1基因定位于细胞质表达,先前的研究表明GR基因家族有两组定位于不同细胞器的基因,GR2基因定位于叶绿体表达,可能与植物在低温胁迫后的耐受性有关,有关这方面的猜测有待进一步的研究证实。